【摘要】：目的:腫瘤相關(guān)DNA存在于患者的血液、唾液、尿液和其他分泌液中,與正常DNA相比,其往往會(huì)發(fā)生堿基突變,而檢測(cè)目標(biāo)DNA的堿基突變有助于腫瘤的篩查和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的檢測(cè)。由于腫瘤早期體液中的腫瘤DNA表達(dá)量很少,因此,尋找一種靈敏、特異的識(shí)別方法用于檢測(cè)目標(biāo)DNA的濃度對(duì)早期診斷腫瘤有著非常重要的意義。α-凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶,它主要參與血液凝血過(guò)程,有促凝和抗凝的雙重作用,其在體內(nèi)的異常表達(dá)與血栓性疾病的發(fā)生直接相關(guān)。然而,目前用于α-凝血酶的檢測(cè)方法卻存在操作繁瑣、試劑價(jià)格昂貴、不夠靈敏等問(wèn)題。本研究利用串聯(lián)的分支整合DNA耦合催化發(fā)夾組裝反應(yīng)(CHA)制成的生物傳感器可直接檢測(cè)目標(biāo)DNA以及人源性α-凝血酶,同時(shí),對(duì)傳感器的可行性、靈敏度和特異性進(jìn)行了分析。方法:1.串聯(lián)體分支整合DNA的形成:目標(biāo)物分子存在的條件下,打開第一條DNA發(fā)夾H1,H1暴露出能打開發(fā)夾H2的序列并打開發(fā)夾H2,H2暴露出的序列打開發(fā)夾H1進(jìn)入下一個(gè)循環(huán),最終形成一系列串聯(lián)體分支整合DNA。當(dāng)缺乏目標(biāo)物時(shí),2種發(fā)夾DNA獨(dú)立存在于同一體系中,相互之間不發(fā)生反應(yīng)。2.CHA反應(yīng):串聯(lián)體分支整合DNA上含有自由的緊密靠近的觸發(fā)鏈,可觸發(fā)CHA的發(fā)生。由于一個(gè)目標(biāo)物分子可引發(fā)一條串聯(lián)分支整合DNA鏈形成,而一條分支整合DNA鏈含有多個(gè)觸發(fā)鏈,從而觸發(fā)多個(gè)CHA反應(yīng),實(shí)現(xiàn)第一次信號(hào)放大。3.類過(guò)氧化物酶催化底物反應(yīng)和信號(hào)進(jìn)一步放大:CHA發(fā)生后,每一條雙鏈DNA產(chǎn)物末端都含有G-四聚體結(jié)構(gòu),當(dāng)加入血紅素后,G-四聚體被激活并具有類過(guò)氧化物酶的活性。在過(guò)氧化氫存在下,其催化ABTS發(fā)生氧化還原反應(yīng),從而在418 nm處形成特征性吸收峰。4.可行性分析:利用非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和紫外可見分光光度計(jì)表征可行性。5.傳感器檢測(cè)的條件優(yōu)化及性能評(píng)價(jià):對(duì)H1與目標(biāo)DNA之間互補(bǔ)堿基的長(zhǎng)度、H2與H3濃度、CHA的孵育時(shí)間和孵育溫度進(jìn)行優(yōu)化;對(duì)傳感器的靈敏度、特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:1.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明,分步的串聯(lián)體分支整合DNA反應(yīng)以及CHA反應(yīng)可行。紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)一步證明目標(biāo)物分子引發(fā)串聯(lián)體分支整合DNA反應(yīng),進(jìn)而由串聯(lián)體上的引發(fā)物鏈引發(fā)CHA的一體化反應(yīng)可行。2.目標(biāo)物分子加入后觸發(fā)信號(hào)放大反應(yīng)體系,產(chǎn)生的具有類過(guò)氧化物酶活性的G-四聚體DNAzyme催化底物并在418 nm處產(chǎn)生特征性吸收峰,根據(jù)吸收峰強(qiáng)度隨濃度的變化制定了標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.基于串聯(lián)體分支整合DNA及CHA的傳感器性能:檢測(cè)目標(biāo)DNA分子的線性范圍是1.0 p M到75 n M,檢測(cè)下限為0.14 p M(S/N=3);檢測(cè)人源性α-凝血酶的線性范圍是1.0 p M到2.5 n M,檢測(cè)下限為0.68 p M(S/N=3);具有單堿基突變識(shí)別能力。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究利用串聯(lián)體分支整合DNA及CHA構(gòu)建了一種新的生物傳感器檢測(cè)目標(biāo)DNA分子以及人源性α-凝血酶,在這一反應(yīng)體系內(nèi),比色反應(yīng)的靈敏度得到顯著提高;在近端錯(cuò)配識(shí)別的作用下,展現(xiàn)出了很高的特異性,實(shí)現(xiàn)了單堿基錯(cuò)配識(shí)別性能;和傳統(tǒng)比色實(shí)驗(yàn)相比,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的傳感器具有低檢測(cè)限、高特異性、操作簡(jiǎn)便,無(wú)需沖洗等步驟;本傳感器在臨床生物醫(yī)學(xué)研究,腫瘤標(biāo)志物檢測(cè),法醫(yī)檢測(cè)中具有很高的應(yīng)用潛力。
[Abstract]:Objective : To study the feasibility , sensitivity and specificity of DNA . 1 . The results of non - denaturing polyacrylamide gel electrophoresis show that the branched integration of DNA and CHA is feasible . The UV - Vis spectrophotometer further proves that the target molecule - induced tandem branch integrates the DNA reaction , and then the detection limit is 0 . 14 p M ( S / N = 3 ) . The detection limit is 0 . 14 p M ( S / N = 3 ) .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TP212.3;R446

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1 白書連;利用催化發(fā)夾組裝的生物傳感器檢測(cè)目標(biāo)DNA和人源性α-凝血酶[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：2122257