本文關(guān)鍵詞：基于核酶開關(guān)的哺乳細(xì)胞內(nèi)硫胺素焦磷酸熒光生物傳感器的建立　出處：《分析化學(xué)》2017年02期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate,TPP)是維生素B1在細(xì)胞內(nèi)的主要活性形式,也是糖、脂肪酸和氨基酸氧化代謝中重要的輔助因子。在細(xì)胞內(nèi),利用TPP適配體與天然核酶組裝成的人工核酶開關(guān)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),目前僅局限于原核、真菌或植物細(xì)胞。本實驗將原核生物中篩選的"Switch-on"與"Switchoff"的兩種類型的TPP核酶開關(guān),運用重疊延伸PCR的方法構(gòu)建于增強綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的3'非翻譯區(qū)(UTR),轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293),通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析,觀察了不同濃度TPP對EGFP表達(dá)能力的調(diào)控。結(jié)果表明,構(gòu)建的兩種"Switch-on"和一種"Switch-off"核酶開關(guān)均表現(xiàn)出明顯的TPP濃度依賴性,且具有良好的特異性,在150μmol/L TPP時分別將EGFP的熒光強度提高3.1倍、1.9倍和降低2.3倍。這種構(gòu)建通過TPP與核酶開關(guān)中其適配體的特異性作用直接將TPP濃度的變化轉(zhuǎn)化為報告基因表達(dá)的改變,利于通過熒光檢測方法實現(xiàn)對哺乳活細(xì)胞內(nèi)代謝物或因子的無標(biāo)記、無損傷、可視、高效的檢測。
[Abstract]:Thiamine pyrophosphate (TPP) is the main active form of vitamin B1 in cells, and it is also a sugar. In the cell, artificial ribozyme switch composed of TPP aptamer and natural ribozyme is used to regulate target gene expression, which is limited to prokaryotic expression. In this study, two types of TPP ribozymes of "Switch-on" and "Switchoff" were selected in prokaryotes. PCR was constructed from the 3'untranslated region of the enhanced green fluorescent protein (EGFP) reporter gene and transfected into human embryonic renal epithelial cells (HEK293). The regulation of EGFP expression by different concentrations of TPP was observed by fluorescence microscope and flow cytometry. The two kinds of "Switch-on" and one "Switch-off" ribozyme switch were constructed in a dose-dependent manner and had good specificity. The fluorescence intensity of EGFP was increased by 3.1 times at 150 渭 mol/L TPP. By 1.9-fold and 2.3-fold reduction, the construction directly transformed the change of TPP concentration into the change of reporter gene expression by the specific action of its aptamer in TPP and ribozyme switch. It is helpful for the detection of metabolites or factors in lactation living cells by fluorescence detection without marking, injury, visualization and high efficiency.
【作者單位】： 安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;中國科學(xué)院合肥物質(zhì)研究院;中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所;
【基金】：國家自然基金資助項目(Nos.21628502,21507156,31300096) 江蘇省青年基金資助項目(Nos.BK20130357,BK20130351)資助~~
【分類號】：O657.3;TP212.3
【正文快照】： 1引言 核酶開關(guān)是近些年出現(xiàn)的一種人工基因調(diào)控開關(guān)。常見的核酶開關(guān)由錘頭狀核酶和適配體組成[1]。作為一種順式作用元件,在特異識別適配體的配體作用下,無需蛋白質(zhì)輔助,即可通過調(diào)節(jié)自身裂解反應(yīng),調(diào)控mRNA的翻譯,已應(yīng)用于多種細(xì)胞的基因調(diào)控[2~6]。迄今,隨著指數(shù)富集配基

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1 戴少波;硫胺素焦磷酸依賴酶催化機理研究[D];西北大學(xué);2012年

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本文編號：1423650