本文關(guān)鍵詞：基于限制性核酸內(nèi)切酶放大技術(shù)的miRNA檢測生物傳感器

  更多相關(guān)文章： 3-WJ結(jié)構(gòu) EXPAR 等溫協(xié)同酶放大 miRNA檢測

【摘要】：微小RNA(miRNA)的異常表達量與癌癥和疾病的發(fā)展相關(guān),所以miRNA已經(jīng)成為一種能夠?qū)Π┌Y診斷和治療組織性的生物標志物。因此,快速高效檢測miRNA新方法的研究變得刻不容緩。最近,在限制性核酸內(nèi)切酶和聚合酶的基礎(chǔ)上,自動的聚合-剪切等溫擴增酶放大過程已廣泛地用于miRNA檢測。EXPAR是一種有前途的高靈敏度,低成本和可用于臨床樣品miRNA實時檢測的非線性放大方法。由于高擴增效率,EXPAR能在短時間內(nèi)迅速放大寡核苷酸鏈數(shù)。我們基于EXPAR放大技術(shù)和酶的使用,設(shè)計了兩個體系來檢測miRNA。一個是基于三通路結(jié)構(gòu)(3-WJ)驅(qū)動的trigger輔助的指數(shù)酶放大(T-EXPEA)超靈敏檢測miRNA;一個是二次使用分子信標的指數(shù)酶放大反應(yīng)用于超靈敏檢測miRNA。我們設(shè)計了一種新型的用三通路(3-WJ)結(jié)構(gòu)驅(qū)動的trigger輔助的指數(shù)酶放大(T-EXPEA)超靈敏檢測miRNA方法,該實驗方案在癌癥診斷和治療領(lǐng)域有很大應(yīng)用潛力。在本試驗中,目標物miRNA可以打開發(fā)夾探針,并引發(fā)反應(yīng),因此特異性地形成穩(wěn)定的3-WJ結(jié)構(gòu)。然后,它可以在聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶的配合下產(chǎn)生下放大。所產(chǎn)生的triggers可用于打開分子信標(MB)和引發(fā)T-EXPEA反應(yīng)。在T-EXPEA部分,產(chǎn)生的指數(shù)triggers來啟動新的T-EXPEA,獲得很大增幅的熒光信號和放大效率。我們方法的特點在于將T-EXPEA和3-WJ結(jié)構(gòu)結(jié)合用于熒光miRNA檢測。值得注意的是,在T-EXPEA部分與3-WJ部分trigger的序列設(shè)計是相同的。另外,在發(fā)夾探針和MB中設(shè)計的限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點是相同的內(nèi)切酶Nt.BbvCI,該設(shè)計提高了反應(yīng)效率,減少了成本。這種方法可以定量檢測特異性序列miRNA,從10 aM到10 pM的動態(tài)范圍,最低檢出限是7.8 aM。第二個實驗方案中,我們設(shè)計了一個可以二次利用分子信標MB、使之二次打開從而產(chǎn)生一個疊加的呈指數(shù)放大趨勢的熒光信號用于超靈敏快速檢測miRNA。在該設(shè)計中,目標物miRNA首先引發(fā)產(chǎn)生一個3-WJ結(jié)構(gòu),在聚合酶和內(nèi)切酶的共同作用下,初次打開一個發(fā)夾狀分子信標,產(chǎn)生初級的熒光信號。并且產(chǎn)生的primer探針可以與一個發(fā)夾探針結(jié)合,并且在聚合酶和內(nèi)切酶的共同作用下產(chǎn)生trigger鏈,此trigger鏈又可以再次引發(fā)分子信標MB,在聚合酶和內(nèi)切酶的共同作用下使之打開,產(chǎn)生二級熒光信號,產(chǎn)生指數(shù)型放大。該方法的檢測范圍較廣,為10 aM-1 pM,檢出限為3.5 aM。
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q503;TP212.3

【參考文獻】

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本文編號：1261764