隨著新型熒光探針、先進(jìn)激光、高靈敏光電探測器等相關(guān)領(lǐng)域的不斷發(fā)展,突破衍射極限的超分辨光學(xué)顯微技術(shù)為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究提供了新的有力工具,其中的單分子定位技術(shù)利用熒光分子的光開關(guān)效應(yīng),實現(xiàn)了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的納米精度超分辨成像.本文介紹了單分子定位超分辨顯微技術(shù)的基本原理與實現(xiàn),例舉了其在細(xì)胞生物學(xué)、組織生物學(xué)以及神經(jīng)科學(xué)等方面的應(yīng)用,討論了該技術(shù)目前的發(fā)展趨勢及可能的改進(jìn)方向,為相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)研究提供參考.超分辨光學(xué)顯微技術(shù)的不斷創(chuàng)新將推動生命科學(xué)的新發(fā)展. 

【文章來源】：光子學(xué)報. 2020,49(09)北大核心

【文章頁數(shù)】：18 頁

【部分圖文】：

熒光蛋白的幾種光開關(guān)機(jī)制示意圖

單分子定位技術(shù)使用特定的熒光分子探針標(biāo)記樣品，通過改變分子所處的外部環(huán)境有效控制其光開關(guān)特性，將空間上重疊的多分子熒光圖像在時間上分離為一系列子圖像，使得每一幀子圖像中只有少量稀疏分布的單分子發(fā)射熒光，即每個衍射極限范圍內(nèi)只有一個熒光分子被激發(fā)．采集成千上萬幀熒光信號隨機(jī)分布的圖像，利用單分子定位算法精確定位每個分子的中心位置．最后，將所有獲得的定位點進(jìn)行疊加，重建出一幅突破衍射極限的超分辨圖像，原理如圖2所示．假設(shè)探測到的單個熒光分子所發(fā)射的光子數(shù)為N，定位該分子視為對其位置進(jìn)行了N次測量，每次測量的不確定性由系統(tǒng)的PSF尺寸決定．一般系統(tǒng)PSF近似呈高斯分布，對應(yīng)的高斯函數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差s與PSF尺寸FWHM滿足關(guān)系定位精度由公式來估算，對應(yīng)分辨率由此可見，SMLM的定位精度與系統(tǒng)PSF尺寸成正比，與單個熒光分子所發(fā)射的光子數(shù)成反比．早在1995年[41],BETZIG E就提出了利用單分子定位技術(shù)提高空間分辨率的概念，并于2006年[26]基于該理論首次開發(fā)出了利用光激活熒光蛋白的光開關(guān)特性實現(xiàn)超分辨的PALM技術(shù)，基本原理如圖3所示．利用光激活綠色熒光蛋白（PA-GFP）標(biāo)記樣品，此類熒光蛋白在未被激活前，激發(fā)時不發(fā)熒光或發(fā)微弱熒光．加載樣品后，采用405nm激活光以低能量脈沖方式照射目標(biāo)區(qū)域，從而激活稀疏分布的少量熒光分子，之后切換561nm激發(fā)光連續(xù)照射，此時只有那些之前被激活的熒光分子發(fā)射熒光，即處于ON態(tài)（圖3B,D），而其它未被激活的分子則處于不發(fā)光的OFF態(tài)，采集并定位這些單分子位置，直至這些發(fā)光分子被漂白，在下一次循環(huán)中不會再被激活（圖3A,C）．多次重復(fù)該“激活-激發(fā)-定位-漂白”過程，最終將所有定位點疊加后重構(gòu)出目標(biāo)結(jié)構(gòu)的超分辨圖像（圖3E′，F(xiàn)′）．

莊小威等[27]提出的基于單分子定位的STORM技術(shù)，其原理（如圖4所示）與PALM十分相似，主要區(qū)別在于所使用的熒光分子探針不同．STORM使用光轉(zhuǎn)換熒光染料（Cy3-Cy5分子對）標(biāo)記樣品，通過交替使用633nm的紅光和532nm的綠光實現(xiàn)熒光分子Cy5的ON-OFF態(tài)轉(zhuǎn)換，具體過程如圖4(a）所示．首先利用高強(qiáng)度633nm紅光持續(xù)照射樣品，在此過程中Cy5分子被激發(fā)至ON態(tài)并迅速變?yōu)镺FF態(tài)，此時利用低強(qiáng)度532nm綠光照射，使少部分隨機(jī)分布的Cy5分子恢復(fù)至ON態(tài)，然后切換633nm紅光照射，使得這些Cy5分子發(fā)射熒光并轉(zhuǎn)換為OFF態(tài)，采集并定位這些單分子信號，不斷重復(fù)該過程直至大部分熒光分子被漂白．在此過程中，激活分子Cy3可以加速熒光分子Cy5從OFF態(tài)到ON態(tài)轉(zhuǎn)換的響應(yīng)時間．圖4 STORM的基本原理[27]

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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