發(fā)布時(shí)間：2020-05-26 19:42

【摘要】：甲基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中的一種,在表觀遺傳調(diào)控中起著非常重要的作用,其機(jī)制研究受到廣泛關(guān)注。核磁共振技術(shù)具有非侵入性,可提供近原位環(huán)境下蛋白質(zhì)原子分辨率結(jié)構(gòu)信息,在蛋白甲基化修飾研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。然而,蛋白甲基化修飾的NMR檢測(cè)往往需要同位素標(biāo)記,很多蛋白的選擇性標(biāo)記困難,不具有普適性。這里我們采用最高量子相關(guān)譜(MAXY)在近原位環(huán)境下研究蛋白質(zhì)的甲基化過(guò)程。由于MAXY譜中甲基基團(tuán)最高量子態(tài)為四量子態(tài),高于其他支鏈基團(tuán),可通過(guò)相干路徑選擇實(shí)現(xiàn)甲基信號(hào)的選擇性檢測(cè)。修飾甲基的化學(xué)位移特殊,遠(yuǎn)離其他支鏈甲基,使得原本二維譜檢測(cè)簡(jiǎn)化成一維譜檢測(cè),大大提高了時(shí)間分辨率,有利于動(dòng)態(tài)過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè);同時(shí),支鏈甲基分布在分子表面,是很重要的相互作用和結(jié)構(gòu)變化探針,因此該技術(shù)提供了一種簡(jiǎn)化的探針,可用于天然豐度蛋白質(zhì)的構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)研究。據(jù)此,我們分別以組蛋白和細(xì)胞色素c為對(duì)象展開(kāi)了相關(guān)研究,主要研究?jī)?nèi)容及其結(jié)果如下:(1)組蛋白H3K4甲基化過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè):組蛋白是核小體的重要組成部分,甲基化是其最重要的翻譯后修飾之一。組蛋白不僅甲基化位點(diǎn)多樣,而且同一甲基化位點(diǎn)可以發(fā)生不同程度地甲基化。組蛋白不同程度、不同位點(diǎn)的甲基化具有不同的表觀遺傳調(diào)控功能。當(dāng)前NMR技術(shù)可在近原位環(huán)境檢測(cè)組蛋白Lys的甲基化過(guò)程,但通常需要選擇性同位素標(biāo)記Lys。對(duì)此,我們采用1H-13C MAXY技術(shù),通過(guò)四量子濾波,實(shí)現(xiàn)了天然豐度蛋白質(zhì)的組蛋白H3多肽甲基化程度及其甲基化過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)。對(duì)不同程度甲基化多肽的檢測(cè)結(jié)果表明,甲基化修飾基團(tuán)的化學(xué)位移通常遠(yuǎn)離常規(guī)支鏈甲基所處區(qū)域,處在支鏈CH區(qū)域,且不同程度甲基化基團(tuán)的化學(xué)位移差異大。對(duì)稀溶液和細(xì)胞裂解液中組蛋白H3多肽的甲基化實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),該技術(shù)可消除復(fù)雜的背景信號(hào)干擾,在近生理?xiàng)l件(細(xì)胞裂解液)實(shí)現(xiàn)組蛋白的甲基化過(guò)程的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)。裂解液中H3的甲基化速率和程度均與稀溶液有很大差異,表明復(fù)雜環(huán)境影響組蛋白的甲基化。(2)基于MAXY表征細(xì)胞色素c的構(gòu)象變化:細(xì)胞色素c是一個(gè)重要的多功能蛋白,它在呼吸鏈及細(xì)胞凋亡中均發(fā)揮著重要功能。細(xì)胞色素c的構(gòu)象變化與其功能密切相關(guān),表征細(xì)胞色素c的構(gòu)象變化對(duì)于明確其發(fā)揮相關(guān)功能的分子機(jī)制至關(guān)重要。NMR是在近原位環(huán)境下表征蛋白構(gòu)象的重要工具,但通常需要13C/15N等同位素標(biāo)記。由于野生型細(xì)胞色素c存在翻譯后修飾,故其同位素標(biāo)記困難。在本文,我們嘗試使用甲基化選擇性檢測(cè)1H-13C MAXY核磁共振技術(shù)來(lái)表征天然提純的野生型細(xì)胞色素c的構(gòu)象變化。通過(guò)1H-13C MAXY核磁共振技術(shù)得到的甲基譜圖甲基信號(hào)分散性好,有效的濾掉了亞甲基、次甲基等其他信號(hào),減少了譜峰的重疊程度,信號(hào)識(shí)別簡(jiǎn)單明了。通過(guò)突變體以及同位素標(biāo)記,我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)突變體細(xì)胞色素c的支鏈甲基歸屬。對(duì)突變體與野生型細(xì)胞色素c的甲基信號(hào),我們發(fā)現(xiàn)兩者信號(hào)幾乎一致,從而指認(rèn)得到了野生型細(xì)胞色素c的甲基信號(hào)。該結(jié)果表明野生型細(xì)胞色素c氧化態(tài)的構(gòu)象與還原態(tài)的構(gòu)象明顯不同。
【圖文】：

配位結(jié)合丟失，使Ｃｙｔｃ獲得過(guò)氧化物酶活性。Ｃｙｔｃ氧化心磷脂（ＣＬ）的�；滃义仙系牟伙柡玩I，破壞膜的完整性。Ｃｙｔｃ釋放至細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因逡逑子１邋（Ａｐａｆ－１）結(jié)合形成凋亡小體，繼續(xù)凋亡途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。逡逑多年以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)在酸＿或乙醇剛處理后，Ｃｙｔｃ會(huì)形成二聚結(jié)構(gòu)。最近，逡逑人們已發(fā)現(xiàn)一個(gè)馬的Ｃｙｔｃ于Ｃ端形成的二聚體的Ｘ射線晶體結(jié)構(gòu)＃１。有趣的是，，逡逑二聚體的連接部位處于Ｑ－Ｉ00ｐ區(qū)，會(huì)導(dǎo)致Ｍｅｔ８０－ｈｅｍｅ配位結(jié)合丟失，并產(chǎn)生過(guò)逡逑氧化物酶活性。事實(shí)上，人們己知二聚體Ｃｙｔｃ會(huì)與線粒體膜有相互作用［４５］。與逡逑單體Ｃｙｔｃ［４６］相比，二聚體Ｃｙｔｃ也顯示出過(guò)氧化物酶活性的增加。其他研宄表明，逡逑單體Ｃｙｔｃ在與膜上心磷脂（ＣＬ）相互作用時(shí)，構(gòu)象變得更為舒展ｔ４７，４８］，并且與逡逑二聚體Ｃｙｔｃ的亞單位Ｘ射線晶體結(jié)構(gòu)［４４］很類似。這表明二聚體Ｃｙｔｃ對(duì)于理解由逡逑Ｃｙｔｃ與ＣＬ之間的相互作用導(dǎo)致的過(guò)氧化物酶活性有重要作用。逡逑＊－ｓ７３逡逑

分別選取了不同程度甲基化Ｈ３多肽作為樣品，對(duì)相應(yīng)方法的可行性進(jìn)行分析。逡逑天然豐度的邋Ｈ３（ａａｌ－２０）Ｋ４Ｍｅｌ，Ｈ３（ａａｌ－２０）邋Ｋ４Ｍｅ２，邋Ｈ３（ａａｌ－２０）邋Ｋ４Ｍｅ３邋的邋ＨＭＱＣ逡逑譜圖與ＭＡＸＹ譜圖如圖２．１所示。由圖可知，ＨＭＱＣ背景復(fù)雜，修飾甲基周圍逡逑存在亞甲基，次甲基信號(hào)，與之相比，ＭＡＸＹ譜圖極度簡(jiǎn)化，譜峰數(shù)量大大降逡逑低。這主要是因?yàn)椴捎昧怂牧孔訛V波，其他亞甲基和次甲基信號(hào)均被消除造成。逡逑僅組蛋白Ｈ３（ａａｌ－２０）的Ｋ４位單、雙、三甲基化信號(hào)和支鏈甲基得到了選擇性觀逡逑測(cè)。甲基化修飾基團(tuán)的化學(xué)位移遠(yuǎn)離常規(guī)支鏈甲基，且甲基化程度不同，其化學(xué)逡逑位移也有很大差異。如三甲基修飾的化學(xué)位移的１Ｈ和１３Ｃ的化學(xué)位移分別為３．０逡逑和５３．０ｐｐｍ，雙甲基化修飾基團(tuán)的４和１３Ｃ的化學(xué)位移分別為２．８和４．２ｐｐｍ，而逡逑支鏈甲基的１Ｈ和１３Ｃ的化學(xué)位移分別＜１．５和２５．０ＰＰｍ，這主要是因?yàn)樾揎椈鶊F(tuán)逡逑是發(fā)生在支鏈Ｎ原子上，Ｎ的吸電子特性使其化學(xué)位移增大，靠近其他支鏈亞逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q75;O482.532

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