【摘要】：微藻生物柴油因環(huán)保、可再生、原料生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)。但天然微藻油脂含量低,且油脂提取成本高,嚴(yán)重影響了微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。利用基因工程手段調(diào)控油脂合成與代謝相關(guān)基因,對(duì)于提高微藻油脂含量、實(shí)現(xiàn)其脂肪酸分泌具有重要意義。�；o酶A合成酶(ACS)能活化生物體內(nèi)的自由脂肪酸,進(jìn)而廣泛參與油脂的合成與代謝反應(yīng)。本研究從萊茵衣藻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)出兩個(gè)ACS基因,通過(guò)RT-PCR克隆其c DNA,并對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行序列分析與功能預(yù)測(cè)。采用酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究其體外功能,確認(rèn)其具有ACS活性。進(jìn)一步構(gòu)建了反義ACS基因的工程藻株,結(jié)合熒光定量PCR和GC-MS檢測(cè),最終證實(shí)萊茵衣藻ACS參與了油脂代謝且促進(jìn)了脂肪酸分泌。具體結(jié)果如下:利用生物信息學(xué)方法從萊茵衣藻基因組中預(yù)測(cè)出兩個(gè)ACS基因,首次克隆其c DNA,分別命名為cracs1和cracs2,其長(zhǎng)度分別為2 004 bp和2 016 bp。對(duì)其編碼蛋白cr ACS1和cr ACS2分析發(fā)現(xiàn),二者均包含ACS的兩個(gè)保守區(qū)域:AMP-binding區(qū)和FACS標(biāo)簽。進(jìn)化樹比對(duì)顯示cr ACS1和cr ACS2與擬南芥的長(zhǎng)鏈ACSs具有較高的同源性,均為長(zhǎng)鏈ACS。萊茵衣藻ACS在酵母YB525中表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),cr ACS1和cr ACS2均能互補(bǔ)酵母YB525的ACS缺陷表型,可活化并利用外源脂肪酸。cr ACS1和cr ACS2均偏好活化長(zhǎng)鏈脂肪酸,其中cr ACS1偏好C16:1和C18:1,cr ACS2偏好C16:0、C18:0、C16:1和C18:1。該結(jié)果表明cr ACS1和cr ACS2具有ACS活性,屬于�；o酶A合成酶家族。獲得了反義cracs1、cracs2基因的工程藻株q-15、p-13。熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),q-15的cracs1表達(dá)量與cc849相比下降53.78%;p-13的cracs2表達(dá)量與cc849相比下降23.67%。此外,研究發(fā)現(xiàn)cracs1與cracs2的m RNA表達(dá)量之間存在關(guān)聯(lián)性,p-13中反義cracs2片段可促進(jìn)cracs1的表達(dá);而q-15中反義cracs1片段可導(dǎo)致cracs2表達(dá)量的下降。工程藻株q-15和p-13的脂肪酸分析結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)總脂含量均明顯上升,同時(shí)都表現(xiàn)出明顯脂肪酸分泌現(xiàn)象。q-15和p-13的胞內(nèi)總脂含量分別為130.1μg/mg、141.6μg/mg,與cc849相比分別上升45%和55%;q-15和p-13分泌的脂肪酸含量分別為13.413mg/109cells和16.89 mg/109cells。綜上所述,本研究首次克隆并探究了萊茵衣藻ACS的功能,成功利用其調(diào)控萊茵衣藻脂肪酸代謝。證明萊茵衣藻ACS不僅促進(jìn)胞內(nèi)脂肪酸的累積,且實(shí)現(xiàn)了脂肪酸的分泌。本研究不僅為ACS調(diào)控萊茵衣藻的油脂合成與代謝研究打下一定基礎(chǔ),也為微藻生物柴油的發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。
【圖文】：

生物柴油生產(chǎn)的簡(jiǎn)易流程圖

圖 2 ACS 參與的代謝途徑[53]源脂肪酸的攝入 ②膜脂的流通 ③脂肪酸的從頭合成 ④三脂酰甘油和固醇的水解 ⑤脂類的合成OLE1 的抑制 ②誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶基因表達(dá) C：①參與囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞器合成 ②信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與配 在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，參與多種代謝途徑（圖 2）。例如：脂肪、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁的合成、脂肪酸合成磷脂或三脂酰甘油，脂肪酸去飽和，蛋白的脂酰化，脂肪酸的降解包括α-、β-、w-氧化降解等這些過(guò)程[輔酶 A 合成酶調(diào)控脂肪酸的研究基輔酶 A 合成酶調(diào)控脂肪酸合成與代謝的研究 廣泛存在于各種生物，在脂肪酸的代謝途徑中具有重要作用。目前一些高、真菌和微藻的長(zhǎng)鏈 ACS（LACS）家族基因已經(jīng)被克隆和分析[54-59]。高物擬南芥含有 9 個(gè) LACS 基因，其中 7 個(gè)能夠互補(bǔ)缺陷 ACS 的酵母表型和遺傳學(xué)研究表明，，其 LACS 活性與質(zhì)體脂肪酸的合成[51]、活化[60]、角質(zhì)肪酸的β-氧化[52]等有密切關(guān)系[62]。其中有關(guān)脂肪酸的合成與代謝方面的研
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q946.5;TE667

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2518375