本文關(guān)鍵詞：擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫響應中的功能研究

  更多相關(guān)文章： 干旱 鹽脅迫 鋁毒 種子休眠 氣孔 側(cè)根 轉(zhuǎn)錄因子 WRKY 擬南芥

【摘要】：干旱、鹽脅迫和酸性土壤中的鋁毒害是造成作物減產(chǎn)的主要非生物逆境,而植物響應這些脅迫的信號轉(zhuǎn)導以及分子調(diào)控機制仍有待進一步的研究和拓展。轉(zhuǎn)錄因子在植物信號調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮了極其重要的作用,它們一方面接受被感知的信號進而調(diào)控下游基因的表達,另一方面又能成為一個節(jié)點,協(xié)調(diào)不同信號途徑之間的相互作用。因此,對轉(zhuǎn)錄因子逆境響應的功能研究是我們從分子水平上認識植物如何適應惡劣環(huán)境的重要基礎。WRKY家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,其調(diào)控范圍涵蓋植物生長發(fā)育和逆境響應等多種生理活動。盡管WRKY蛋白在生物脅迫反應中已得到了廣泛的研究,但其在非生物脅迫應答中的研究還處于起步階段。本文對擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的33個WRKY基因進行表達分析,最終篩選到了2個WRKY (WRKY46和WRKY41)參與快速響應過氧化氫和鎘的處理,隨后對這2個基因的功能進行了系統(tǒng)的研究。主要結(jié)果分為以下四個方面： 1、WRKY46調(diào)控滲透脅迫響應以及光依賴的氣孔運動 在多種非生物脅迫的處理中,WRKY46對水分脅迫(干旱、滲透和鹽脅迫)的響應尤為明顯。干旱和鹽脅迫在短時間內(nèi)便可顯著提高WRKY46的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平。WRKY46T-DNA插入突變體對干旱和鹽脅迫十分敏感,表現(xiàn)為突變體地上部生長差于野生型。然而,WRKY46過表達株系在平板處理條件下(封閉的環(huán)境)對鹽和滲透脅迫有較高的耐性,但在土培條件下(開闊的環(huán)境)卻對干旱和鹽脅迫非常敏感。原因是WRKY46過表達植株的葉片具有較高的失水率。進一步研究發(fā)現(xiàn),WRKY46的過表達可以抑制保衛(wèi)細胞中ROS (reactive oxygen species)的產(chǎn)生,從而破壞ABA (abscisic acid)誘導的氣孔關(guān)閉過程。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)WRKY46受光的誘導表達,并且其在保衛(wèi)細胞中的表達不受干旱等處理的影響。WRKY46在保衛(wèi)細胞中的主要作用可能是參與光依賴的氣孔打開過程。基因芯片分析發(fā)現(xiàn),WRKY46調(diào)控了一系列參與細胞滲透保護和氧化還原平衡的基因的表達。此外,WRKY46也通過調(diào)控QQS (QUA-QUINE STARCH)基因的表達來調(diào)控保衛(wèi)細胞中的淀粉代謝,從而調(diào)節(jié)氣孔的打開過程。 因此, WRKY46在脅迫應答和氣孔調(diào)控中發(fā)揮了兩種獨立的作用：一是調(diào)控干旱和鹽脅迫下植物細胞的滲透保護和降低氧化脅迫；二是通過調(diào)控保衛(wèi)細胞中淀粉的代謝來調(diào)節(jié)氣孔的打開。 2、WRKY46調(diào)控鹽和滲透脅迫下的側(cè)根發(fā)育 組織定位分析表明,WRKY46在側(cè)根發(fā)育初期的根原基以及成熟側(cè)根的中柱中表達。WRKY46的功能缺失導致植株在鹽和滲透脅迫下的側(cè)根發(fā)育受到明顯的抑制(相對于野生型)。相反,WRKY46的過表達能夠增強植株在脅迫下的側(cè)根發(fā)育。外源添加生長素可以極大地回復wrky46突變體在脅迫下的側(cè)根表型,而生長素極性運輸抑制劑(TIBA)同時抑制野生型和WRKY46過表達植株在脅迫下的側(cè)根發(fā)育,說明WRKY46對側(cè)根的調(diào)控依賴生長素。對WRKY46的表達模式分析發(fā)現(xiàn),WRKY46在根中的表達受到ABA的顯著抑制,但同時在鹽或滲透脅迫下,WRKY46也受到ABA以外的信號調(diào)控。DR5:GUS在wrky46突變體中的表達明顯低于在野生型中的表達。與此吻合的是,突變體根中游離IAA的含量出現(xiàn)降低,而橋連IAA的含量有所提高(相對于野生型)；而WRKY46過表達株系的IAA含量變化與突變體正好相反�；虮磉_分析發(fā)現(xiàn),WRKY46在鹽或滲透脅迫下調(diào)控ABI4(ABA INSENSITIVE4)和參與生長素橋連的相關(guān)基因的表達。染色質(zhì)免疫共沉淀進一步證實WRKY46可以直接結(jié)合到這些基因的啟動子上。以上結(jié)果證明,WRKY46通過調(diào)控ABA信號途徑和生長素內(nèi)穩(wěn)態(tài)進而參與前饋抑制鹽或滲透脅迫對植物側(cè)根的抑制。 3. WRKY46調(diào)控鋁誘導的蘋果酸分泌 ALMT1編碼蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白,是擬南芥一關(guān)鍵耐鋁基因。我們發(fā)現(xiàn)在基因芯片中,ALMT1的表達明顯受到WRKY46的抑制。在鋁處理條件下,WRKY46的表達在處理3小時后出現(xiàn)顯著的下調(diào),而ALMT1的表達受鋁處理的誘導。而且在組織表達上,WRKY46和ALMT1在擬南芥根中存在共同的表達區(qū)域,即兩者均在根的中柱表達,說明兩者可能存在調(diào)控關(guān)系。表型分析發(fā)現(xiàn),wrky46突變體在鋁處理下表現(xiàn)出較高的鋁耐性(相對于野生型),并且突變體含有較低的根系鋁含量。進一步分析發(fā)現(xiàn),ALMT1在wrky46突變體中的表達明顯提高,從而增強突變體根系蘋果酸的分泌,緩解鋁毒。煙草中的瞬時表達實驗表明,WRKY46可以抑制ALMT1的表達。利用酵母單雜和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進一步證實,WRKY46可以直接結(jié)合到ALMT1啟動子中的W-box上。以上結(jié)果證明,WRKY46是關(guān)鍵耐鋁基因ALMT1的負調(diào)控因子,WRKY46的功能缺失提高根系蘋果的分泌,從而降低根系的鋁含量,提高植株對鋁的耐性。 4、WRKY41調(diào)控種子休眠 盡管WRKY41也能快速響應過氧化氫和鹽脅迫的誘導,但WRKY41的功能缺失突變體wrky41對這些處理的響應與野生型無明顯差異。研究發(fā)現(xiàn),WRKY41主要在種子中表達。WRKY41的功能缺失導致種子的初生休眠和熱脅迫下產(chǎn)生的次生休眠都顯著降低,并且wrky41的種子萌發(fā)和幼苗生長對ABA不敏感。而這種表型與ABI3(ABA INSENSITIVE3)的功能缺失十分相似�；虮磉_分析發(fā)現(xiàn),WRKY41的缺失明顯降低ABI3在種子發(fā)育以及萌發(fā)過程中的表達,而過表達WRKY41可以提高ABI3的表達。而且,在wrky41中過表達ABI3可以完全回復突變體種子休眠相關(guān)的表型。凝膠阻滯和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證明,WRKY41可以直接結(jié)合到ABI3啟動子的3個W-box上。同時轉(zhuǎn)錄激活實驗表明這些W-box對ABI3的表達十分重要。此外,WRKY41不在ABA的下游,并且WRKY41對ABI3的調(diào)控不依賴于ABA和其它ABI3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。但高濃度的ABA可以反饋抑制WRKY41的表達。最后,對wrky41aba2雙突變的分析表明,WRKY41和ABA共同調(diào)控ABI3的表達,進而調(diào)控種子休眠。
【關(guān)鍵詞】：干旱 鹽脅迫 鋁毒 種子休眠 氣孔 側(cè)根 轉(zhuǎn)錄因子 WRKY 擬南芥
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q945
【目錄】：

• 致謝7-8
• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 縮略語表15-23
• 第1章 文獻綜述23-39
• 1.1 植物轉(zhuǎn)錄因子概述23-24
• 1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子24-33
• 1.2.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、分類及結(jié)合位點24-27
• 1.2.2 WRKY家族的起源與進化27
• 1.2.3 WRKY基因的生物學功能27-33
• 1.3 ROS33-37
• 1.3.1 ROS的產(chǎn)生33
• 1.3.2 ROS的毒害作用33-34
• 1.3.3 ROS的清除機制34-35
• 1.3.4 ROS的生物學功能35-37
• 1.4 問題的提出、擬解決的問題以及技術(shù)路線37-39
• 1.4.1 問題的提出和擬解決的問題37-38
• 1.4.2 技術(shù)路線38-39
• 第2章 WRKY基因響應ROS或氧化脅迫39-46
• 2.1 材料和方法39-41
• 2.1.1 植物材料39
• 2.1.2 植物培養(yǎng)及處理條件39
• 2.1.3 基因表達分析39-41
• 2.2 結(jié)果41-45
• 2.2.1 WRKY基因響應過氧化氫41-42
• 2.2.2 WRKY基因響應重金屬鎘42-45
• 2.2.3 WRKY基因的時間表達分析45
• 2.3 討論45-46
• 第3章 WRKY46調(diào)控擬南芥滲透脅迫響應以及光依賴的氣孔運動46-85
• 3.1 前言46-48
• 3.1.1 干旱和鹽脅迫引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導46-47
• 3.1.2 水分脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控47-48
• 3.1.3 光誘導的氣孔運動48
• 3.2 問題的提出、擬解決的問題以及技術(shù)路線48-50
• 3.2.1 問題的提出和擬解決的問題48-49
• 3.2.2 技術(shù)路線49-50
• 3.3 材料和方法50-60
• 3.3.1 植物材料50
• 3.3.2 植物培養(yǎng)條件50
• 3.3.3 載體構(gòu)建50-52
• 3.3.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?/span>52-53
• 3.3.5 T-DNA插入突變體純合株系的PCR鑒定53
• 3.3.6 處理條件53-54
• 3.3.7 葉片失水率測定54
• 3.3.8 ABA含量測定54
• 3.3.9 氣孔運動生理實驗54-55
• 3.3.10 ROS檢測55
• 3.3.11 MDA含量測定55
• 3.3.12 GUS染色及活性測定55-56
• 3.3.13 保衛(wèi)細胞和葉肉細胞原生質(zhì)體分離56
• 3.3.14 保衛(wèi)細胞中淀粉和蘋果酸含量的測定56-57
• 3.3.15 基因表達分析57
• 3.3.16 蛋白提取和Western blot測定57-58
• 3.3.17 染色質(zhì)免疫共沉淀58-60
• 3.4 結(jié)果60-80
• 3.4.1 WRKY46響應干旱和鹽脅迫的誘導60-62
• 3.4.2 WRKY46功能缺失突變體對干旱和鹽脅迫表現(xiàn)敏感62-65
• 3.4.3 WRKY46過表達株系的表型分析65
• 3.4.4 過表達WRKY46影響ABA誘導的氣孔關(guān)閉過程65-69
• 3.4.5 WRKY46在保衛(wèi)細胞中表達69-71
• 3.4.6 WRKY46參與調(diào)控光誘導的氣孔打開過程71
• 3.4.7 WRKY46調(diào)控細胞滲透保護和氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)基因的表達71-77
• 3.4.8 WRKY46調(diào)控保衛(wèi)細胞的淀粉代謝77-80
• 3.5 討論80-85
• 3.5.1 WRKY46作為早期因子響應干旱、鹽以及氧化脅迫80
• 3.5.2 WRKY46參與生物脅迫和非生物脅迫反應80-83
• 3.5.3 WRKY46參與氣孔的打開過程83-85
• 第4章 WRKY46調(diào)控鹽和滲透脅迫下擬南芥的側(cè)根發(fā)育85-109
• 4.1 前言85-87
• 4.2 問題的提出、擬解決的問題及技術(shù)路線87-89
• 4.2.1 問題的提出和擬解決的問題87-88
• 4.2.2 技術(shù)路線88-89
• 4.3 材料和方法89-92
• 4.3.1 實驗材料89
• 4.3.2 植物培養(yǎng)條件(同3.3.2)89
• 4.3.3 處理條件89-90
• 4.3.4 T-DNA插入突變體純合株系的PCR鑒定(同3.3.5)90
• 4.3.5 GUS染色(同3.3.12)90
• 4.3.6 IAA含量檢測90
• 4.3.7 基因表達分析90
• 4.3.8 染色質(zhì)免疫共沉淀(同3.3.17)90-92
• 4.4 結(jié)果92-105
• 4.4.1 WRKY46在側(cè)根中表達92-93
• 4.4.2 WRKY46的功能缺失抑制側(cè)根在鹽和滲透脅迫下的發(fā)育93-96
• 4.4.3 生長素回復wrky46突變體在鹽或滲透脅迫下側(cè)根的生長96
• 4.4.4 過表達WRKY46促進鹽或滲透脅迫下側(cè)根的發(fā)育96
• 4.4.5 生長素、ABA、鹽和滲透脅迫調(diào)控WRKY46的表達96-100
• 4.4.6 WRKY46影響鹽或滲透脅迫下根中的生長素水平100-101
• 4.4.7 WRKY46調(diào)控鹽或滲透脅迫下ABI4和生長素橋連基因的表達101-103
• 4.4.8 WRKY46與ABI4和生長素橋連基因啟動子體內(nèi)結(jié)合103-105
• 4.5 討論105-109
• 第5章 WRKY46調(diào)控鋁誘導的蘋果酸分泌109-134
• 5.1 前言109-111
• 5.1.1 植物的鋁毒害機制109-110
• 5.1.2 植物的耐鋁機制110-111
• 5.2 問題的提出、擬解決的問題及技術(shù)路線111-113
• 5.2.1 問題的提出和擬解決的問題111-112
• 5.2.2 技術(shù)路線112-113
• 5.3 材料和方法113-117
• 5.3.1 植物材料113
• 5.3.2 植物培養(yǎng)條件(同3.3.2)113
• 5.3.3 鋁處理條件113
• 5.3.4 GUS染色和活性測定(同3.3.12)113
• 5.3.5 根系鋁含量測定113-114
• 5.3.6 根系有機酸分泌的測定114
• 5.3.7 煙草葉片中的瞬時表達114-115
• 5.3.8 酵母單雜實驗115
• 5.3.9 基因表達分析115
• 5.3.10 染色質(zhì)免疫共沉淀115-117
• 5.4 結(jié)果117-130
• 5.4.1 WRKY46響應鋁117-120
• 5.4.2 WRKY46的功能缺失提高擬南芥的鋁耐性120
• 5.4.3 WRKY46調(diào)控ALMT1的表達以及蘋果酸的分泌120-126
• 5.4.4 WRKY46通過直接結(jié)合ALMT1的啟動子調(diào)控其表達126-130
• 5.5 討論130-134
• 第6章 WRKY41調(diào)控擬南芥的種子休眠134-180
• 6.1 前言134-136
• 6.2 問題的提出、擬解決的問題及技術(shù)路線136-138
• 6.2.1 問題的提出和擬解決的問題136-137
• 6.2.2 技術(shù)路線137-138
• 6.3 材料和方法138-144
• 6.3.1 實驗材料138
• 6.3.2 植物培養(yǎng)條件(同3.3.2)138
• 6.3.3 載體構(gòu)建138-139
• 6.3.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?同3.3.4)139
• 6.3.5 T-DNA插入突變體純合株系的PCR鑒定(同3.3.5)139
• 6.3.6 發(fā)芽與根伸長實驗139
• 6.3.7 干旱處理和失水率測定139-140
• 6.3.8 種子ABA含量的測定140
• 6.3.9 GUS染色(同3.3.12)140
• 6.3.10 基因表達分析140
• 6.3.11 蛋白提取和Western blot測定140
• 6.3.12 煙草葉片瞬時表達實驗140-141
• 6.3.13 重組蛋白的純化和凝膠阻滯實驗(EMSA)141
• 6.3.14 染色質(zhì)免疫共沉淀141-144
• 6.4 結(jié)果144-170
• 6.4.1 WRKY41的功能缺失導致種子的初生休眠降低144-147
• 6.4.2 WRKY41主要在種子中表達147
• 6.4.3 wrky41突變體的種子萌發(fā)和幼苗生長對ABA不敏感147-151
• 6.4.4 WRKY41正調(diào)控ABA信號途徑和種子成熟相關(guān)基因的表達151-153
• 6.4.5 WRKY41的功能缺失降低種子的熱抑制休眠153-155
• 6.4.6 WRKY41的功能缺失影響莢果中種子成熟相關(guān)基因的表達155
• 6.4.7 WRKY41在種子成熟及萌發(fā)階段調(diào)控ABI3的表達155-158
• 6.4.8 WRKY41不在ABA下游調(diào)控ABI3的表達158-162
• 6.4.9 WRKY41對ABI3的調(diào)控不依賴于ABA的合成代謝、ABA信號途徑以及其它調(diào)控ABI3轉(zhuǎn)錄表達的因子162-165
• 6.4.10 WRKY41體外結(jié)合ABI3啟動子165
• 6.4.11 WRKY41在煙草葉片中轉(zhuǎn)錄激活ABI3啟動子165-167
• 6.4.12 WRKY41與ABI3啟動子體內(nèi)結(jié)合167-168
• 6.4.13 高濃度的ABA反饋調(diào)控WRKY41的表達168-170
• 6.5 討論170-180
• 6.5.1 WRKY41轉(zhuǎn)錄激活ABI3的表達并調(diào)控種子的休眠171-173
• 6.5.2 WRKY41與ABA信號途徑173-174
• 6.5.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在種子發(fā)育和萌發(fā)過程中的作用174-180
• 第7章 全文總結(jié)180-183
• 7.1 主要研究結(jié)論180-181
• 7.2 創(chuàng)新點181
• 7.3 研究展望181-183
• 參考文獻183-220
• 個人簡歷220-221
• 博士期間發(fā)表的論文221

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張秀海,黃叢林,沈元月,曹鳴慶;植物抗旱基因工程研究進展[J];生物技術(shù)通報;2001年04期

2 ;Aluminum-activated Oxalate Secretion does not Associate with Internal Content among Some Oxalate Accumulators[J];Journal of Integrative Plant Biology;2008年09期

3 楊建立,何云峰,鄭紹建;植物耐鋁機理研究進展[J];植物營養(yǎng)與肥料學報;2005年06期

，

本文編號：888839