本文關(guān)鍵詞：基于微小凹圖式的C17.2細(xì)胞三維聚集體形成及其電生物物理特性研究

  更多相關(guān)文章： 細(xì)胞聚集體 神經(jīng)干細(xì)胞 有限元分析 TMRM 靜息膜電位

【摘要】：細(xì)胞的體外培養(yǎng)是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)，而將細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)調(diào)整到與體內(nèi)細(xì)胞類似的生長(zhǎng)狀態(tài)是廣大科研工作者一致在努力追求的目標(biāo)。體外三維培養(yǎng)是最理想的解決辦法。然而目前大部分的三維培養(yǎng)方法或多或少存在細(xì)胞生長(zhǎng)均一性較差、結(jié)構(gòu)構(gòu)型不均勻、不利于進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)等問題。以微小凹結(jié)構(gòu)為代表的三維聚集體培養(yǎng)方法是近些年較多研究的新方法，能一定程度上克服上述問題。但目前此類方法還不能同時(shí)實(shí)現(xiàn)使細(xì)胞即能充分的進(jìn)行養(yǎng)分交換又能與基底有一定的粘附，從而較為準(zhǔn)確的還原體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。本研究將先解決這一問題，構(gòu)建一個(gè)基于細(xì)胞凹面剝離行為的C17.2神經(jīng)干細(xì)胞三維聚集體培養(yǎng)基底。 我們基于紫外光光刻技術(shù)和軟光刻技術(shù)制備了9種微小凹圖式結(jié)構(gòu)其中6種結(jié)構(gòu)為五連孔微小凹，使用材料為聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolicacid，PLGA)和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)。與C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的初步復(fù)合培養(yǎng)結(jié)果顯示，基底在經(jīng)過等離子氧蝕刻和多聚賴氨酸裱襯后，細(xì)胞接種后能快速進(jìn)入微小凹，并能很好的在其上貼壁生長(zhǎng)，而不同材質(zhì)的基底對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分布的影響幾乎沒有差異。C17.2細(xì)胞在微小凹中以擴(kuò)增條件培養(yǎng)2天后仍維持均一的干細(xì)胞特性，這初步說明基底拓?fù)湫蚊驳淖兓粫?huì)使C17.2細(xì)胞發(fā)生分化。 利用延遲拍攝技術(shù)對(duì)同一微小凹內(nèi)細(xì)胞行為的觀察發(fā)現(xiàn)C17.2細(xì)胞接種后一開始逐漸貼壁，并相互連接成細(xì)胞串，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞串將從微小凹側(cè)壁上剝落，并形成三維懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞聚集體。利用掃描電鏡也觀察到類似的結(jié)果。CFSE熒光染色結(jié)果顯示大部分三維生長(zhǎng)細(xì)胞位于微小凹中靠近小凹口的區(qū)域懸浮生長(zhǎng)。通過Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)較小的孔徑和較窄的通道寬度有利于細(xì)胞聚集體的形成。結(jié)合細(xì)胞增殖統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D80-W20和D100-W20結(jié)構(gòu)的細(xì)胞倍增時(shí)間最短，同時(shí)這兩種結(jié)構(gòu)中細(xì)胞聚集體的形成率也最高。對(duì)F-actin和vinculin進(jìn)行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞未形成成熟的粘著斑，但骨架排布有一定的差異。 通過有限元方法對(duì)細(xì)胞串在微小凹側(cè)面上剝離行為的模擬，發(fā)現(xiàn)微小凹模型中的初始剝離發(fā)生時(shí)的預(yù)應(yīng)力(Critical peeling prestress，CPP)遠(yuǎn)小于平面模型中的CPP值，說明細(xì)胞在微小凹側(cè)壁上比在平面培養(yǎng)時(shí)更容易剝離下來。而6種不同微小凹之間的CPP差異并不明顯。通過對(duì)細(xì)胞瞬時(shí)彈性模量(Cell instantaneouselastic modulus，EC)和粘附層彈性模量(Adhesion interface elastic modulus，EA)這兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行全面考察，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)細(xì)胞剝離能力的PM/F(微小凹模型的CPP與平面模型的CPP的比值)與kC/A(EC與EA的比值)有較好的正相關(guān)性。 上述研究表明，結(jié)合細(xì)胞的凹面剝離行為，我們成功的構(gòu)建了一種可用于C17.2神經(jīng)干細(xì)胞三維化懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)基底。 本研究的另一方面將聚焦于評(píng)價(jià)不同生長(zhǎng)狀態(tài)C17.2細(xì)胞的電生物物理特性上。靜息膜電位(Resting membrane potential，RMP)是細(xì)胞的一個(gè)重要的電生物物理指標(biāo)，它對(duì)許多功能性的膜蛋白具有調(diào)節(jié)作用，從而實(shí)現(xiàn)電刺激信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換，并進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等。然而目前利用膜片鉗技術(shù)要實(shí)現(xiàn)對(duì)聚集體內(nèi)細(xì)胞的膜電位檢測(cè)存在困難，因此本研究將使用電勢(shì)熒光染料作為指示劑實(shí)現(xiàn)C17.2細(xì)胞膜電位的檢測(cè)，同時(shí)將改進(jìn)現(xiàn)有該技術(shù)檢測(cè)精度不高的缺陷。由于細(xì)胞膜鈉鉀通透性比值(PNa/K)能一定程度反映出細(xì)胞膜上不同離子通道的發(fā)育程度，因此我們RMP檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上對(duì)這個(gè)電生物物理指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。 研究中我們首次將雙結(jié)合位點(diǎn)的擬合方法用于對(duì)細(xì)胞核區(qū)四甲基羅丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM)非特異性吸附量的標(biāo)定，對(duì)梯度高鉀去極化的C17.2細(xì)胞進(jìn)行RMP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用TMRM法檢測(cè)到的膜電位值與用膜片鉗檢測(cè)到的值基本一致，這很好的證明了此方法的可靠性和準(zhǔn)確性。同時(shí)在利用CoroNa進(jìn)行了胞內(nèi)鈉離子濃度的檢測(cè)的基礎(chǔ)上，結(jié)合戈德曼(Goldman)方程對(duì)細(xì)胞膜鈉鉀通透性比值進(jìn)行了計(jì)算。最后將建立的新方法與Loew建立的方法以及我們前期采用的方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示新方法比以往方法精度更高。 我們進(jìn)而對(duì)不同生長(zhǎng)狀態(tài)的C17.2細(xì)胞的電生物物理特性進(jìn)行了考察。先對(duì)不同生長(zhǎng)天數(shù)的C17.2細(xì)胞的RMP和PNa/K進(jìn)行了檢測(cè)，在細(xì)胞接種前3天，細(xì)胞膜電位存在一個(gè)逐漸變負(fù)的過程。之后我們采用了五種分化方法對(duì)C17.2細(xì)胞進(jìn)行分化，最終選擇了分化結(jié)果較為穩(wěn)定的利用多聚賴氨酸進(jìn)行基底裱襯來誘導(dǎo)分化的方法。通過形態(tài)學(xué)和免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞都已經(jīng)開始分化，，但還未完全分化成成熟的神經(jīng)元。進(jìn)行的電生物物理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，C17.2細(xì)胞雖然已經(jīng)開始分化，但其RMP和PNa/K還沒有發(fā)生顯著變化。最后我們檢測(cè)了在D80-W40微小凹中的C17.2細(xì)胞的RMP和PNa/K，結(jié)果表明三維生長(zhǎng)的C17.2細(xì)胞的RMP比平面生長(zhǎng)的細(xì)胞要更正，PNa/K也要更高。 在上一部分的研究中我們首次利用雙結(jié)合位點(diǎn)的擬合方法提高了基于TMRM的電位檢測(cè)精度，并實(shí)現(xiàn)了不同生長(zhǎng)狀態(tài)的C17.2細(xì)胞的電生物物理特性的評(píng)價(jià)。 綜上，本研究中我們制備了一種連孔微小凹基底，生長(zhǎng)于其中的C17.2神經(jīng)干細(xì)胞將自組裝成懸浮生長(zhǎng)的三維細(xì)胞聚集體。這將為體外研究神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化等行為提供一個(gè)很好的平臺(tái)，同時(shí)還可用于基于細(xì)胞的生物傳感器領(lǐng)域。本研究中我們還建立了一種具有較高精度的非侵入性的細(xì)胞靜息膜電位和鈉鉀離子通透性比值的檢測(cè)方法，這將彌補(bǔ)膜片鉗技術(shù)的一些不足。在此基礎(chǔ)上對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的不同狀態(tài)的電生物物理特性研究對(duì)認(rèn)識(shí)神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞聚集體 神經(jīng)干細(xì)胞 有限元分析 TMRM 靜息膜電位
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-9
• 目錄9-11
• 主要縮略詞11-12
• 1 緒論12-30
• 1.1 問題的提出及研究意義12-15
• 1.1.1 構(gòu)建用于神經(jīng)干細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的陣列基底12-13
• 1.1.2 基于 TMRM 的細(xì)胞電生物物理評(píng)價(jià)方法13-15
• 1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀15-26
• 1.2.1 基于 MEMS 的細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的研究現(xiàn)狀15-17
• 1.2.2 凹形結(jié)構(gòu)在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用及細(xì)胞在其中的生長(zhǎng)行為分析17-20
• 1.2.3 細(xì)胞力學(xué)模型的研究進(jìn)展20-23
• 1.2.4 基于 TMRM 的電位檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀23-26
• 1.3 本文研究的目的和研究?jī)?nèi)容26-30
• 1.3.1 本文研究的目的26
• 1.3.2 本文研究的主要內(nèi)容26-27
• 1.3.3 本文研究的創(chuàng)新點(diǎn)27-30
• 2 微小凹圖式的制備及與 C17.2 細(xì)胞的初步復(fù)合30-44
• 2.1 引言30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法31-35
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器31-32
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-35
• 2.3 結(jié)果與討論35-41
• 2.3.1 硅主模和 PDMS 模具的加工35-36
• 2.3.2 微小凹圖式基底的制備36-37
• 2.3.3 微小凹圖式表面的親水化處理及表征37-39
• 2.3.4 C17.2 細(xì)胞與不同材料微小凹圖式的初步復(fù)合39-40
• 2.3.5 細(xì)胞在微小凹中的干細(xì)胞特性考察40-41
• 2.4 小結(jié)41-44
• 3 微小凹內(nèi)三維細(xì)胞聚集體的形成44-60
• 3.1 引言44-45
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法45-47
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器45
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法45-47
• 3.3 結(jié)果與討論47-59
• 3.3.1 C17.2 細(xì)胞在微小凹中形成三維細(xì)胞聚集體的過程47-51
• 3.3.2 C17.2 細(xì)胞在微小凹中的增殖統(tǒng)計(jì)51-53
• 3.3.3 微小凹中細(xì)胞聚集體形成過程的熒光染色及統(tǒng)計(jì)分析53-58
• 3.3.4 C17.2 細(xì)胞的骨架和粘著斑蛋白染色58-59
• 3.4 小結(jié)59-60
• 4 細(xì)胞凹面剝離行為的有限元模擬60-80
• 4.1 引言60-61
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法61-66
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)方法61-66
• 4.3 結(jié)果與討論66-77
• 4.3.1 連孔微小凹模型與平面模型的有限元模擬66-70
• 4.3.2 影響細(xì)胞剝離的力學(xué)參數(shù)70-75
• 4.3.3 不同細(xì)胞在凹面中的剝離能力75-77
• 4.4 小結(jié)77-80
• 5 基于 TMRM 的細(xì)胞電生物物理評(píng)價(jià)體系的建立80-100
• 5.1 引言80-81
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法81-86
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器81
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法81-86
• 5.3 結(jié)果與討論86-98
• 5.3.1 TMRM 熒光強(qiáng)度的線性標(biāo)定86-87
• 5.3.2 TMRM 檢測(cè)參數(shù)的確立87-89
• 5.3.3 TMRM 染料的熒光紅移分析89-90
• 5.3.4 TMRM 非特異性吸附的標(biāo)定90-91
• 5.3.5 梯度去極化時(shí) RMP 檢測(cè)及膜片鉗驗(yàn)證91-92
• 5.3.6 胞內(nèi)鈉離子濃度的檢測(cè)方法的建立92-94
• 5.3.7 鈉鉀通透性比值檢測(cè)方法的建立94-96
• 5.3.8 與 Loew 的方法和課題組前期的方法進(jìn)行對(duì)比96-98
• 5.4 小結(jié)98-100
• 6 C17.2 細(xì)胞在不同生長(zhǎng)狀態(tài)中的電生物物理特性100-114
• 6.1 引言100
• 6.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法100-104
• 6.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器100-102
• 6.2.2 實(shí)驗(yàn)方法102-104
• 6.3 結(jié)果與討論104-112
• 6.3.1 不同培養(yǎng)天數(shù)的 C17.2 細(xì)胞的電生物物理評(píng)價(jià)104-105
• 6.3.2 C17.2 細(xì)胞的分化及其電生物物理評(píng)價(jià)105-110
• 6.3.3 三維化生長(zhǎng)的細(xì)胞的電生物物理評(píng)價(jià)110-112
• 6.4 小結(jié)112-114
• 7 結(jié)論與展望114-118
• 7.1 主要結(jié)論114-115
• 7.2 后續(xù)研究工作的展望115-118
• 致謝118-120
• 參考文獻(xiàn)120-134
• 附錄134
• A. 作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄134
• B. 作者在攻讀博士學(xué)位期間取得的科研成果目錄134
• C. 作者在攻讀博士學(xué)位期間參加的科研項(xiàng)目134

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張利光;吳澤志;宋兆全;黃豈平;廖彥劍;;三維微小凹圖式的制備及其與C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的復(fù)合[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2012年03期

本文編號(hào)：780608