本文關(guān)鍵詞：麥長管蚜翅型分化相關(guān)的生態(tài)學(xué)及microRNA水平的分子機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： 麥長管蚜 翅型分化 環(huán)境因素 microRNA 高通量測序

【摘要】：蚜蟲是研究翅二型性的理想模式昆蟲,可結(jié)合遺傳因素和環(huán)境因素變化研究翅分化機(jī)制。由于外界環(huán)境因子的影響,蚜蟲在發(fā)育過程中呈現(xiàn)兩種不同的生物型,有翅蚜和無翅蚜。這種表觀形態(tài)的變化主要是由于受到環(huán)境因子的脅迫,通過選擇性地表達(dá)基因從而達(dá)到了調(diào)控的作用,這屬于典型的表觀遺傳學(xué)范疇。micro RNA(mi RNA)作為重要的后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控因子,參與生物生長發(fā)育的各個生命過程,是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容。隨著近年來大量昆蟲mi RNAs的鑒定,明確其在昆蟲生長發(fā)育中的作用已成為新的研究熱點(diǎn),而且從mi RNA角度對昆蟲翅發(fā)育的研究也取得了一些進(jìn)展。因此,開展麥長管蚜翅型分化相關(guān)的生態(tài)學(xué)及mi RNA水平的分子機(jī)理方面的研究,為解析麥蚜的翅型分化機(jī)理奠定一定的理論基礎(chǔ)。本研究利用體視顯微鏡、掃描電鏡技術(shù)對麥長管蚜不同翅型不同齡期成若蚜的形態(tài)測量學(xué)和外部形態(tài)特征進(jìn)行研究;通過設(shè)定不同的外界因子,對麥長管蚜翅型分化的生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究;運(yùn)用高通量測序和q RT-PCR等技術(shù),對麥長管蚜翅型分化的mi RNA調(diào)控機(jī)理方面進(jìn)行了研究。主要得到以下研究結(jié)果:首先對麥長管蚜不同翅型不同齡期成若蚜的形態(tài)測量學(xué)和外部形態(tài)特征進(jìn)行研究,結(jié)果表明麥長管蚜1、2齡若蚜外部形態(tài)無明顯差別,觸角均為5節(jié);3齡有翅若蚜中胸發(fā)達(dá),可見初生翅芽,至成蟲期發(fā)育為完整的翅;3齡無翅若蚜中胸結(jié)構(gòu)簡單,未見翅芽,3齡至成蚜觸角均為6節(jié);1齡若蚜尾片呈瘤狀,著生2根剛毛;2、3、4齡若蚜尾片呈圓錐形;有翅成蚜尾片呈長錐形,無翅成蚜呈長舌狀,2齡若蚜至成蚜尾片均著生6根以上剛毛;1齡到3齡若蚜腹管的外部形態(tài)基本相似,呈圓柱狀,4齡若蚜腹管端部開始膨大,近端部變細(xì)。有翅成蚜和無翅成蚜腹管基本無差異,與若蚜相比,近頂端表面均呈現(xiàn)多角形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過設(shè)定不同的擁擠度、溫度、母代效應(yīng)、寄主營養(yǎng)等因素,觀察對麥長管蚜翅型分化影響。結(jié)果表明初產(chǎn)若蚜的擁擠度越大,越有利于其形成有翅個體;較高的溫度和較低的溫度處理條件下,均有利于麥長管蚜初齡若蚜有翅蚜的形成;擁擠處理母代,對后代個體的翅型分化存在影響,處理不同翅型的母代對后代個體翅型分化也存在差異;寄主營養(yǎng)不僅影響當(dāng)代若蚜表型的變化,同樣影響第二代的表型變化。通過構(gòu)建麥長管蚜有翅成蚜和無翅成蚜的mi RNAs文庫,利用高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法,測序結(jié)果中一共得到了146個保守的mi RNAs,152個新的mi RNAs,且34%以上的mi RNAs的長度分布在22nt,這符合典型的mi RNAs長度分布。采用數(shù)據(jù)歸一化和差異檢驗方法(P值小于0.1、0.05以及0.01),篩選出52個表達(dá)差異顯著mi RNAs,其中30個上調(diào)控的mi RNAs和22個下調(diào)控的mi RNAs。通過預(yù)測差異表達(dá)的mi RNAs的靶基因,利用基因本體論GO、KEGG信號通路分析,初步篩選出可能與麥長管蚜翅型分化相關(guān)的9個mi RNAs,包括7個保守的mi RNAs(Let-7、mi R-1_L-1、mi R-7、mi R-277、mi R-8、m R-9a_R-2和mi R-315)和2個新的mi RNAs(PC-5p-113190_15和PC-3p-2743_844)。通過q RT-PCR技術(shù)分析9個mi RNAs在兩翅型中的表達(dá)譜,結(jié)果表明9個mi RNAs在有翅成蚜中的表達(dá)量均高于無翅成蚜中的表達(dá)量,且有5個保守的mi RNAs(Let-7、mi R-1_L-1、mi R-7、mi R-277和mi R-8)的表達(dá)量差異顯著,推測這些mi RNAs可能在麥長管蚜的翅型發(fā)育中起重要調(diào)控作用。通過構(gòu)建麥長管蚜翅型分化敏感期(有翅蚜和無翅蚜的偽胚胎、1齡和2齡)的mi RNAs文庫,經(jīng)過初步過濾篩選得到60%的clean數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。預(yù)測得到保守的pre-mi RNA 85個,unique-mi RNA 150個,新預(yù)測得到的新的pre-mi RNA 1050個,unique mi RNA 1016個。通過差異檢驗方法對兩兩數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異比對,發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的mi RNAs。將預(yù)測得到的保守的mi RNAs與其他昆蟲的mi RNAs進(jìn)行保守性分析,表明其與鄰近物種豌豆蚜Acyrthosiphon pisum保守性較高,其次是赤擬谷盜Tribolium castaneum和家蠶Bombyx mori。通過q RT-PCR技術(shù)對9個mi RNAs在兩翅型不同齡期的表達(dá)譜進(jìn)行分析,表明不同mi RNAs在麥長管蚜不同的翅型和不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量不同,進(jìn)一步地揭示mi RNAs表達(dá)的特異性和時序性。選擇兩個前期預(yù)測得到的可能與麥長管蚜的翅型分化相關(guān)mi RNAs(mi R-7和mi R-277),根據(jù)mi RNA的成熟序列設(shè)計,人工合成雙鏈小RNA(mi RNA agomir),通過模擬體內(nèi)mi RNA,與靶基因相互配對,增強(qiáng)mi RNAs在體內(nèi)的表達(dá)。用人工飼料將mi RNA agomir稀釋至300 n M,將單頭飼養(yǎng)三代的無翅成蚜初產(chǎn)24 h內(nèi)的若蚜,每10頭放入含有相應(yīng)mi RNA agomir的飼蚜器中飼喂不同的時間。運(yùn)用q RT-PCR技術(shù)檢測mi RNA agomir的過表達(dá)效應(yīng),結(jié)果表明,與對照相比,隨著飼喂時間的延長,目的基因mi R-7和mi R-277的表達(dá)量也隨著增加。將飼喂不同時間的若蚜,單頭單株接入到新鮮的盆栽麥株上。4-5天后,觀察發(fā)現(xiàn)處理后的若蚜均能夠正常生長,未觀察到麥長管蚜若蚜翅型分化比例的變化。
【關(guān)鍵詞】：麥長管蚜 翅型分化 環(huán)境因素 microRNA 高通量測序
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S435.12
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-22
• 英文縮略表22-23
• 第一章 引言23-39
• 1.1 昆蟲翅發(fā)育的研究進(jìn)展24-27
• 1.2 影響蚜蟲翅型分化的因子27-29
• 1.2.1 外界因子27-28
• 1.2.2 內(nèi)部因子28-29
• 1.3 MicroRNA的研究概況29-32
• 1.3.1 MiRNA的作用機(jī)制31
• 1.3.2 MiRNA的研究方法31-32
• 1.4 MiRNA在昆蟲中的研究32-35
• 1.5 MiRNA在昆蟲翅型分化上的研究35-37
• 1.6 研究目的和意義37
• 1.7 研究內(nèi)容與擬解決的關(guān)鍵問題37
• 1.7.1 研究內(nèi)容37
• 1.7.2 擬解決的關(guān)鍵問題37
• 1.8 技術(shù)路線37-39
• 1.8.1 外界因子對麥長管蚜翅型分化的影響37-38
• 1.8.2 MiRNA對麥長管蚜翅型分化的研究38-39
• 第二章 麥長管蚜兩翅型外部形態(tài)的比較39-52
• 2.1 試驗材料39-40
• 2.1.1 供試?yán)ハx39
• 2.1.2 飼養(yǎng)皿的制備39
• 2.1.3 主要實(shí)驗儀器39-40
• 2.2 試驗方法40
• 2.2.1 形態(tài)學(xué)測量40
• 2.2.2 掃描電鏡樣品的制備40
• 2.3 統(tǒng)計分析40
• 2.4 結(jié)果與分析40-49
• 2.4.1 麥長管蚜有翅型與無翅型各齡期若蚜及成蚜形態(tài)測量比較40-43
• 2.4.2 麥長管蚜不同齡期若蚜及成蚜中胸外部形態(tài)的比較43
• 2.4.3 麥長管蚜不同齡期若蚜及成蚜觸角外部形態(tài)比較43-45
• 2.4.4 麥長管蚜不同齡期若蚜及成蚜尾片外部形態(tài)的比較45
• 2.4.5 麥長管蚜不同齡期若蚜及成蚜腹管外部形態(tài)的比較45-49
• 2.5 結(jié)論與討論49-51
• 2.5.1 麥長管蚜兩翅型各齡期若蚜及成蚜形態(tài)測量學(xué)研究49
• 2.5.2 麥長管蚜兩翅型各齡期若蚜及成蚜外部形態(tài)的研究49-51
• 2.6 小結(jié)51-52
• 第三章 外界因子對麥長管蚜翅型分化的影響52-66
• 3.1 試驗材料52-53
• 3.1.1 供試?yán)ハx52
• 3.1.2 飼養(yǎng)皿的制備52
• 3.1.3 全人工飼料配制52
• 3.1.4 飼蚜器的制備52-53
• 3.2 主要試劑和儀器53
• 3.3 試驗方法53-55
• 3.3.1 擁擠效應(yīng)53
• 3.3.2 溫度效應(yīng)53
• 3.3.3 母代效應(yīng)53-54
• 3.3.4 營養(yǎng)效應(yīng)54-55
• 3.4 數(shù)據(jù)處理55
• 3.5 結(jié)果與分析55-64
• 3.5.1 不同擁擠度對麥長管蚜初產(chǎn)若蚜翅型分化的影響55
• 3.5.2 溫度對麥長管蚜初產(chǎn)若蚜翅型分化的影響55-57
• 3.5.3 母代效應(yīng)對麥長管蚜若蚜翅型分化的影響57-58
• 3.5.4 寄主營養(yǎng)對麥長管蚜翅型分化的影響58-64
• 3.6 結(jié)論與討論64-65
• 3.7 小結(jié)65-66
• 第四章 麥長管蚜有翅成蚜和無翅成蚜miRNAs的深度測序66-90
• 4.1 試驗材料66-67
• 4.1.1 供試?yán)ハx66
• 4.1.2 主要數(shù)據(jù)庫及軟件66-67
• 4.1.3 主要試劑和儀器67
• 4.2 試驗方法67-70
• 4.2.1 總RNA樣本的提取67
• 4.2.2 麥長管蚜miRNAs文庫的構(gòu)建和高通量測序67-68
• 4.2.3 MiRNAs生物信息學(xué)分析68
• 4.2.4 MiRNAs二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測68-69
• 4.2.5 兩樣本miRNAs的差異分析69
• 4.2.6 靶基因功能的預(yù)測和Pathway分析69-70
• 4.2.7 翅型分化相關(guān)miRNAs的篩選70
• 4.3 結(jié)果與分析70-87
• 4.3.1 RNA樣品質(zhì)量檢測70-71
• 4.3.2 麥長管蚜miRNAs高通量測序及生物信息學(xué)分析71-75
• 4.3.3 麥長管蚜兩翅型miRNAs的鑒定75-76
• 4.3.4 麥長管蚜兩翅型中差異基因的篩選76-78
• 4.3.5 麥長管蚜兩種翅型miRNAs的核酸偏移性分析78
• 4.3.6 麥長管蚜兩個文庫中miRNAs的保守性分析78-80
• 4.3.7 麥長管蚜兩翅型中miRNAs的靶標(biāo)預(yù)測80-82
• 4.3.8 翅型分化相關(guān)的miRNAs的篩選及同源性分析82-87
• 4.4 結(jié)論與討論87-88
• 4.4.1 麥長管蚜的miRNAs的一般特征87
• 4.4.2 麥長管蚜保守的miRNAs和新的miRNAs87-88
• 4.4.3 MiRNAs的功能及靶標(biāo)預(yù)測88
• 4.4.4 與翅型分化相關(guān)的miRNAs的篩選88
• 4.5 小結(jié)88-90
• 第五章 麥長管蚜翅型分化相關(guān)miRNAs的克隆及表達(dá)譜分析90-113
• 5.1 試驗材料90-93
• 5.1.1 供試?yán)ハx90
• 5.1.2 數(shù)據(jù)來源90-91
• 5.1.3 主要試劑91
• 5.1.4 主要溶液配置91
• 5.1.5 主要儀器設(shè)備91-92
• 5.1.6 引物設(shè)計92-93
• 5.2 試驗方法93-98
• 5.2.1 總RNA的提取93-94
• 5.2.2 總RNA的檢測94
• 5.2.3 cDNA的合成94
• 5.2.4 RT-PCR反應(yīng)體系94-96
• 5.2.5 PCR產(chǎn)物的回收96
• 5.2.6 連接轉(zhuǎn)化96
• 5.2.7 PCR鑒定陽性克隆及序列測定96-97
• 5.2.8 qRT-PCR定量分析97-98
• 5.2.9 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作98
• 5.2.10 熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析98
• 5.3 結(jié)果與分析98-111
• 5.3.1 總RNA的提取98-99
• 5.3.2 MiRNA成熟序列的克隆99-100
• 5.3.3 內(nèi)參U6的克隆與序列分析100-102
• 5.3.4 9 個miRNAs及內(nèi)參U6上機(jī)檢測引物的特異性102-108
• 5.3.5 9 個miRNAs在兩翅型中的表達(dá)譜分析108-111
• 5.4 結(jié)論與討論111-112
• 5.5 小結(jié)112-113
• 第六章 有翅和無翅若蚜miRNAs的深度測序及相關(guān)miRNAs表達(dá)譜分析113-126
• 6.1 試驗材料113-114
• 6.1.1 麥長管蚜若蚜及成蚜的收集113-114
• 6.1.2 主要數(shù)據(jù)庫及軟件114
• 6.1.3 主要試劑114
• 6.1.4 主要溶液配置114
• 6.1.5 主要儀器114
• 6.1.6 引物設(shè)計114
• 6.2 實(shí)驗方法114-115
• 6.2.1 麥長管蚜miRNAs文庫的構(gòu)建、高通量測序及生物信息學(xué)分析 . 926.2.2 總RNA的提取及檢測114
• 6.2.3 cDNA的合成114
• 6.2.4 RT-PCR反應(yīng)體系114
• 6.2.5 qRT-PCR定量分析114-115
• 6.2.6 數(shù)據(jù)分析115
• 6.3 結(jié)果與分析115-124
• 6.3.1 麥長管蚜miRNAs高通量測序及生物信息學(xué)分析115-119
• 6.3.2 總RNA的提取及檢測119-120
• 6.3.3 9 個miRNAs在兩翅型不同齡期中的表達(dá)120-121
• 6.3.4 9 個miRNAs在兩翅型不同齡期中的表達(dá)譜分析121-124
• 6.4 結(jié)論與討論124-125
• 6.4.1 麥長管蚜不同齡期miRNAs的一般特征124
• 6.4.2 9 個miRNAs在兩翅型不同齡期的表達(dá)譜分析124-125
• 6.5 小結(jié)125-126
• 第七章 翅型分化相關(guān)miRNAs的功能驗證126-136
• 7.1 試驗材料126-127
• 7.1.1 供試?yán)ハx126-127
• 7.1.2 主要試劑和儀器127
• 7.1.3 MiRNA agomir設(shè)計與合成127
• 7.2 試驗方法127-128
• 7.2.1 miR-7 agomir和miR-277 agomir的飼喂127
• 7.2.2 總RNA的提取127-128
• 7.2.3 PCR檢測miRNAs在飼喂miRNA agomir后的表達(dá)128
• 7.2.4 qRT-PCR熒光定量檢測miRNA agomir的過表達(dá)128
• 7.2.5 MiRNAs過表達(dá)對麥長管蚜翅型分化的影響128
• 7.2.6 數(shù)據(jù)分析128
• 7.3 結(jié)果與分析128-134
• 7.3.1 不同濃度miRNA agomir飼喂時間的死亡率128-130
• 7.3.2 總RNA提取及檢測130-132
• 7.3.3 PCR檢測miRNAs及內(nèi)參U6在各個處理樣品中的擴(kuò)增132
• 7.3.4 人工飼喂miRNA agomir對相應(yīng)mi RNAs表達(dá)量的影響132-134
• 7.3.5 飼喂miRNA agomir對麥長管蚜若蚜表型的影響134
• 7.4 討論與結(jié)論134-135
• 7.5 小結(jié)135-136
• 第八章全文總結(jié)136-139
• 8.1 主要研究結(jié)果136-137
• 8.1.1 麥長管蚜兩翅型不同齡期形態(tài)學(xué)的比較136
• 8.1.2 外界因子對麥長管蚜翅型分化的影響136
• 8.1.3 麥長管蚜miRNAs文庫136-137
• 8.1.4 翅型分化相關(guān)的miRNAs表達(dá)譜分析及功能研究137
• 8.2 本研究的創(chuàng)新性137
• 8.3 下一步工作展望137-139
• 參考文獻(xiàn)139-154
• 致謝154-156
• 作者簡歷156-157

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 張潤志,梁宏斌,張廣學(xué),劉晏良,杜秉仁;我國麥雙尾蚜的研究概況[J];昆蟲學(xué)報;1999年S1期

2 戴華國,吳曉毅,武淑文;褐飛虱體內(nèi)保幼激素滴度變化及其與翅型分化的關(guān)系[J];昆蟲學(xué)報;2001年01期

3 杜永均，嚴(yán)福順，，唐覺;大豆蚜觸角嗅覺感器結(jié)構(gòu)及其功能[J];昆蟲學(xué)報;1995年01期

4 鄒運(yùn)鼎,楊義和,章炳旺,胡麗娟,李甲林,黃世祥;棉花苗期棉株內(nèi)含物與棉蚜種群消長動態(tài)及成蚜翅型分化的關(guān)系[J];昆蟲知識;1991年01期

5 于文娟;陳巨蓮;程登發(fā);孫京瑞;;麥蚜Cdc42基因的準(zhǔn)確組織定位和定量分析方法研究[J];昆蟲知識;2010年06期

6 董玉瑋,侯進(jìn)慧,朱必才,李培青,龐永紅;表觀遺傳學(xué)的相關(guān)概念和研究進(jìn)展[J];生物學(xué)雜志;2005年01期

7 吳振廷;趙慧麗;吳成方;;棉花苗期植株營養(yǎng)物質(zhì)變化對棉蚜生存的影響[J];植物保護(hù)學(xué)報;1990年01期

8 曹雅忠;尹姣;李克斌;張克誠;李賢慶;;小麥蚜蟲不斷猖獗原因及控制對策的探討[J];植物保護(hù);2006年05期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 蔣紅玲;麥長管蚜G蛋白β和γ亞基的基因克隆及其相互作用蛋白的篩選[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2004年

本文編號：588622