本文關(guān)鍵詞：生物激發(fā)子與氧化還原相關(guān)信號(hào)對(duì)植物生長(zhǎng)和抗病性的調(diào)控作用

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【摘要】： 隨著人們對(duì)農(nóng)作物上使用農(nóng)藥的關(guān)心，尋找一種安的保護(hù)農(nóng)作物的方法是全世界努力的方向。生防細(xì)菌和其他一些天然來源的材料在病害防治和提高產(chǎn)量上有著巨大的應(yīng)用潛力。Pseudomonas和Bacillus species是一類非常重要的生防細(xì)菌，以多種機(jī)理保護(hù)植物，也能促進(jìn)種子發(fā)芽和植物生長(zhǎng)。Harpin是多種植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的Ⅲ型效應(yīng)因子的蛋白質(zhì)，在病原菌侵染的時(shí)候泌出激發(fā)植物的多種反應(yīng)，外源施用到植物上能引起多種有利效應(yīng)。HpaG_(xoo)，Xanthomonas oryzae pv．oryzae產(chǎn)生的一種harpin蛋白質(zhì)，能激發(fā)植物對(duì)病原菌和昆蟲的防衛(wèi)反應(yīng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，hpaG_(xoo)的轉(zhuǎn)基因煙草系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance，SAR)受到誘導(dǎo)。生防細(xì)菌在根部的定殖能誘導(dǎo)植物的ISR(induced systemic resistance，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性)，ISR與SAR拮抗，賦予植物截然不同的抗病機(jī)理。因此，Ⅲ型效應(yīng)因子和生防細(xì)菌一起使用很可能比其中一個(gè)單獨(dú)使用對(duì)植物具有更好的誘導(dǎo)作用。本研究的目的是探清生防細(xì)菌和Ⅲ型效應(yīng)因子是如何互作的，如何影響植物的生長(zhǎng)和抗病性。P．cepacia P6854和B．subtilisB-916對(duì)水稻紋枯病有比較好的防效，我們產(chǎn)生了hpaG_(xoo)的轉(zhuǎn)基因水稻(品種R109)的一些株系，研究發(fā)現(xiàn)HpaG_(xoo)-expressing rice line 1 (HER1)生長(zhǎng)較快，對(duì)鹽脅迫和病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)較強(qiáng)。 Elicitin是疫霉菌產(chǎn)生的一類寄主特異性蛋白質(zhì)激發(fā)子，能誘導(dǎo)多種煙屬植物、蘿卜和蕓苔產(chǎn)生過敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，但對(duì)番茄、馬鈴薯等茄科植物，多數(shù)十字花科植物等無(wú)效。Elicitin不僅能誘導(dǎo)植物的過敏反應(yīng)，也能誘導(dǎo)多種植物的多種防衛(wèi)反應(yīng)，例如：可以誘導(dǎo)煙草抗黑脛病(P．parasitica)和由Xanthomonascampestris pv armoraciae引起的病害，也能使煙草抗TMV的侵染。Harpins和elicitins這兩類重要的激發(fā)子，誘導(dǎo)植物抗病、抗逆的機(jī)理既有相似之處，又有不同，二者共同作用于植物時(shí)，是否能協(xié)同作用，需要進(jìn)一步研究。在本研究中構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)兩種激發(fā)子的工程菌，研究了該雙元激發(fā)子的工程菌的蛋白粗提液與單元激發(fā)子蛋白粗提液引起煙草的微敏反應(yīng)和系統(tǒng)抗病性的差異。 核黃素(VB_2)在細(xì)菌和高等生物內(nèi)是核黃素結(jié)合輔酶FMN和FAD的重要成分，F(xiàn)MN和FAD是主要的酶促反應(yīng)如氫化物、氧和電子傳遞反應(yīng)的酶的輔酶因子，是一種多功能性的維生素，對(duì)動(dòng)植物、微生物的生長(zhǎng)、抗病都有很重要的作用。核黃素在植物和微生物中都能自我合成，合成途徑的倒數(shù)第二步是由2，4-二氫喋啶合酶(lumazine synthase，LS)催化的，倒數(shù)第一步是由核黃素合酶(riboflavin synthase，RS)催化的。動(dòng)物和人類都缺少這兩種酶，，但是很多細(xì)菌和酵母卻依賴這兩種酶形成內(nèi)源核黃素，很久以來LS和RS蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)得到很好的研究，用來設(shè)計(jì)疫苗，治療人類和動(dòng)物的疾病，很多細(xì)菌和酵母編碼LS和RS蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)得到克隆。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)LS與茉莉酸途徑相交叉，與根對(duì)茉莉酸的敏感性、植物的抗病性密切相關(guān)。由此可推斷水稻上的OsLS和OsRS很可能存在著目前不為所知的功能，在植物上編碼這兩個(gè)酶的基因的報(bào)道不多，尤其是水稻的這兩個(gè)基因根本還沒得到克隆。 硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)是一種小分子量蛋白質(zhì)，催化巰基-二硫鍵的交換反應(yīng)，參與細(xì)胞還原環(huán)境的調(diào)節(jié)，在不同的組織和器官內(nèi)有不同的構(gòu)象，具有多功能性。目前已經(jīng)在多種微生物、植物和動(dòng)物內(nèi)克隆到該基因，細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體內(nèi)都有多種構(gòu)象的硫氧還蛋白，除了能消除氧脅迫，這種蛋白質(zhì)越來越多的功能被發(fā)現(xiàn)。煙草上該基因(NtTRX)的功能研究甚少，在生長(zhǎng)和抗病性上的功能尚未見報(bào)道。 本博士論文的研究目的就是初步研究清楚激發(fā)子HpaG_(xoo)與生防細(xì)菌P．cepacia和B．subtilis或者激發(fā)子ParAl一起使用時(shí)對(duì)植物的生長(zhǎng)、抗病性和過敏反應(yīng)的影響是否存在互作；水稻的核黃素合成過程的酶促步驟的OsLS和OsRS基因和煙草的其中一個(gè)氧化還原作用的NtTRX基因(NtTRXh)在植物的生長(zhǎng)、抗病性、細(xì)胞死亡和活性氧脅迫上的作用。研究結(jié)果如下： 1生物激發(fā)子與生防細(xì)菌協(xié)同作用影響檀物的生長(zhǎng)、抗病和過敏反應(yīng) 為了搞清生防細(xì)菌和HpaG_(Xoo)在作物上一起存在時(shí)是否能夠?qū)χ参锏纳L(zhǎng)和抗病有更好的作用，研究了P．cepacia和B．subtilis在野生型水稻R109和表達(dá)hpaG_(xoo)的水稻株系HER1上的作用。與野生型R109相比，HER1的長(zhǎng)勢(shì)較好、產(chǎn)量高、對(duì)病害和鹽脅迫的抗性強(qiáng)。與水處理的對(duì)照相比，P．cepacia和B．subtilis的定殖促進(jìn)R109和HER1根的生長(zhǎng)，也能促進(jìn)R109莖葉的生長(zhǎng)，但是HER1莖葉的生長(zhǎng)受到抑制。接種紋枯病菌(Rhizoctonia solani)后用P．cepacia和B．subtilis處理，R109和HER1的發(fā)病程度都比對(duì)照輕，而且HER1有更好的抗性，這說明P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在誘導(dǎo)植物的抗病性上相互協(xié)作。P．cepacia和B．subtilis在根部定殖后，HER1和R109上一些與生長(zhǎng)和防衛(wèi)密切相關(guān)的基因具有不同的表達(dá)譜。在R109的根內(nèi)，調(diào)控植物生長(zhǎng)的OsARF1表達(dá)量與P．cepacia和B．subtilis對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)作用是一致的，相反在HER1的莖葉內(nèi)，OsARF1表達(dá)量與P．cepacia和B．subtilis對(duì)水稻的抑制作用相一致。在R109和HER1內(nèi)參與植物生長(zhǎng)的編碼延展蛋白的OsEXP1對(duì)P．cepacia的反應(yīng)在莖葉內(nèi)與生長(zhǎng)一致，但是在根內(nèi)卻不一致。OsMAPK編碼細(xì)胞分裂素激活的蛋白質(zhì)激酶，調(diào)控水稻內(nèi)對(duì)鹽和病菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)，P．cepacia和B．subtilis處理后，R109內(nèi)OsMAPK的早期表達(dá)與抗病性是一致的，但是HER1受P．cepacia處理還是不處理，OsMAPK的表達(dá)量都是相似的。顯然P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在水稻的生長(zhǎng)和抗病性上的互作是不同的，然而P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在抗病性方面的協(xié)作在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有巨大的應(yīng)用潛力，生防細(xì)菌、Ⅲ型效應(yīng)因子和病原菌的互作原理值得深入研究。 ParAl和hpaG_(xoo)基因同時(shí)連接到表達(dá)載體pET30a(+)上，構(gòu)建二元重組質(zhì)粒pET30a(+)：：parAl：：hpaG_(xoo)，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，生成工程菌株BL21：：parAl：：ApaG_(xoo)。Tris-Tricine緩l栂低車?yán)i痙⑾鄭辛教

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