本文關鍵詞：全氟化合物PFOA、PFOS內分泌干擾效應的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：全氟化合物（PFCs）是一類具有重要應用價值的有機化合物，因其具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、表面活性、疏水疏脂等特性，被廣泛應用于工業(yè)和民用領域。PFCs廣泛分布在各種環(huán)境介質和生物體內，且具有難降解性和生物蓄積性，是一種新型持久性有機污染物（POPs）。近年來，PFCs對生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來的不利影響受到全球的普遍關注，成為環(huán)境科學和毒理學領域的研究熱點。 研究表明，PFCs能造成機體的內分泌系統(tǒng)發(fā)生紊亂，已成為環(huán)境內分泌干擾效應物（EDCs）篩檢的重點。全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）是兩種典型的PFCs，目前尚沒有對其內分泌干擾活性的完整研究。國際上EDCs篩選程序中推薦采用體內（in vivo）和體外（in vitro）試驗的組合測試法。本項目采用代表性PFCs（PFOA、PFOS）作為研究對象，通過體外成組方法篩選受試物的擬/抗雌激素受體（ER）、雄激素受體（AR）、甲狀腺激素受體（TR）活性、過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）活性及對類固醇激素合成的影響，利用模式生物斑馬魚、SD大鼠，在體內水平研究PFOA、PFOS對機體內分泌系統(tǒng)的影響及作用機制，綜合評價PFCs的內分泌干擾效應。 第一部分 體外試驗篩選PFOA、PFOS的內分泌干擾活性 第一節(jié)PFOA、PFOS對激素受體的干擾活性 目的 環(huán)境化合物可以通過受體介導途徑發(fā)揮內分泌干擾效應，采用受體介導的報告基因試驗體系，檢測和評價PFOA、PFOS對雌激素受體（ER）、雄激素受體（AR）、甲狀腺激素受體（TR）、過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）激動或拮抗作用。 方法 通過瞬時轉染，將激素受體（ER、TR、PPAR）表達質粒、含有相應激素反應元件的熒光素酶（Luc）報告基因質粒，轉染到激素受體陰性的CV-1細胞中，建立ER、TR、PPAR介導的報告基因試驗方法，用來檢測PFOA、PFOS的擬/抗雌激素、甲狀腺激素、過氧化物酶體增殖劑激活受體活性；利用穩(wěn)定轉染雄激素反應原件報告基因的MDA-Kb2細胞來檢測PFOA、PFOS的擬/抗雄激素活性。 結果 在ER介導的報告基因試驗中，FPOA、PFOS單獨作用，不能顯著誘導報告基因Luc的表達；與1×10-9M E2共同作用，在受試濃度3×10-9-3×10-7M內可協(xié)同E2增強報告基因Luc的表達。在AR介導的報告基因試驗中，未發(fā)現PFOA、PFOS對Luc有明顯的誘導和抑制作用。在TR介導的報告基因試驗中，PFOA（1×10-8-3×10-7M）、PFOS（1×10-7M、3×10-7M）能抑制5×10-9M T3誘導的Luc表達量。在PPAR介導的報告基因試驗中，PFOA、PFOS在受試范圍內表現出PPAR激動作用。 結論 PFOA、PFOS具有雌激素協(xié)同活性、抗甲狀腺激素活性、PPAR激動活性。 第二節(jié)PFOA、PFOS對類固醇激素合成的影響 目的 環(huán)境化合物可以通過非受體介導途徑來發(fā)揮內分泌干擾效應，通過研究PFOA、PFOS對類固醇激素合成過程的影響，來評價它們的類固醇激素合成干擾效應。 方法 采用人腎上腺皮質瘤細胞H295R，檢測PFOA、PFOS作用后對H295R細胞中類固醇激素（雌二醇和睪酮，即E2和T）水平、類固醇激素合成過程中關鍵酶基因及關鍵調控因子（SF-1）表達的影響。 結果 PFOA在1×10-8M及更高濃度時，增加細胞內E2的水平，在3×10-8M及以上，抑制T的水平。PFOS在3×10-8M及以上，增加E2的表達，在1×10-7M和3×10-7M濃度時，降低T的表達。PFOA、PFOS可以不同程度的改變類固醇合成過程中關鍵酶基因的表達。在10種與類固醇激素合成相關的基因中，PFOA作用后顯著上調17βHSD1、3βHSD2、CYP11B2、CYP19的表達，下調CYP17、17βHSD4、CYP11A的表達。PFOS暴露后顯著上調HMGR、StAR、CYP11A、CYP19、3βHSD2、CYP11B2的表達，下調CYP17、17βHSD1、CYP21的表達。PFOA暴露還可導致類固醇合成關鍵調控因子SF-1的基因和蛋白表達水平降低。 結論 PFOA、PFOS可以影響H295R細胞中類固醇激素的合成過程，具有類固醇激素合成干擾效應。 第二部分 體內試驗研究PFOA、PFOS的內分泌干擾效應 第一節(jié)PFOA、PFOS對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響 目的 利用模式生物斑馬魚，研究PFOA、PFOS短期暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育、內分泌相關基因以及整體基因表達的影響。 方法 受精后4h（4hpf）的斑馬魚胚胎，用100、200、500μg/L的PFOA、PFOS染毒至120hpf。觀察斑馬魚胚胎/幼魚的生長狀況，包括胚胎死亡、孵化、生長發(fā)育、有無胚胎發(fā)育畸形等情況。檢測120hpf的斑馬魚幼魚體內內分泌相關基因（包括雌激素受體表達基因esr1、esr2b，甲狀腺早期分化關鍵基因hhex、pax8，類固醇激素合成基因cyp19a、cyp19b、cyp17）的表達情況。在此基礎上，進行單一濃度多暴露終點的斑馬魚胚胎暴露試驗。選擇500μg/L的PFOA、PFOS在斑馬魚4hpf-120hpf期間染毒，染毒至12hpf、24hpf、48hpf、72hpf、96hpf、120hpf，觀察各時間點的胚胎發(fā)育情況，選取暴露至120hpf的斑馬魚幼魚，利用斑馬魚表達譜芯片檢測整體基因的表達情況，分析篩選出關鍵差異表達基因。 結果 在4hpf-120hpf染毒期間，受試濃度下的PFOA、PFOS對斑馬魚胚胎/幼魚的生長發(fā)育沒有產生明顯影響，但可引起斑馬魚幼魚內分泌相關基因的表達發(fā)生改變。與對照組相比，500μg/L的PFOA引起esr1基因水平的上調，對esr2b的表達無影響；200μg/L、500μg/L的PFOA能顯著增加hhex、pax8的表達量；PFOA對類固醇合成酶相關基因的影響不大。在最高濃度下，PFOS暴露使esr1的表達量增加、esr2b的表達量降低；PFOS濃度依賴性的增加hhex和pax8的表達；200μg/L、500μg/L的PFOS暴露能顯著抑制cyp19a、cyp19b、cyp17的表達。120hpf的斑馬魚表達譜芯片結果提示，多個通路上的多種基因在PFOS暴露后發(fā)生改變，差異表達基因主要參與到細胞過程、代謝過程、生物調控、發(fā)育等生物學過程。 結論 PFOA、PFOS暴露可對斑馬魚的基因表達產生影響，發(fā)揮潛在的干擾效應。 第二節(jié)PFOA、PFOS對大鼠青春期發(fā)育的影響 目的 環(huán)境化合物暴露與青春期啟動時間的異常密切相關。流行病學研究發(fā)現PFOA、PFOS的暴露和青春期啟動的改變有關，但對其干擾青春期發(fā)育的相關機制一直未得到闡明。我們采用雌性大鼠模型，研究PFOA、PFOS在關鍵時間段暴露對雌性青春期啟動和發(fā)育的影響，并探究其相關機制。 方法 采用SD雌性大鼠，在新生期（出生后1-5天，PND1-5）和青春前期（出生后26-30天，PND26-30）兩個暴露階段分別進行不同劑量的PFOA、PFOS（0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg）染毒。測定大鼠出生時、PND15、PND25、PND35、陰道開口日的體重和肛門-生殖器距離（AGD），記錄雌鼠進入青春期的年齡（陰道開口時間）、首次發(fā)情期時間、雌性周期，檢測血清雌激素和促黃體生成素（LH）的水平，計算卵巢系數，進行卵巢組織病理分析和卵泡計數。采用Q-RT-PCR分析下丘腦Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)中Kiss1、Kiss1r、ERα、ERβ基因表達的變化，采用免疫組織化學方法檢測kisspeptin蛋白表達水平，，以探討該系統(tǒng)在PFOA、PFOS所致的青春期啟動時間改變中發(fā)揮的作用。選擇染毒雌鼠的肝臟組織，測定肝臟系數，進行肝臟功能相關血生化指標的檢測，采用GC-MS進行血清脂肪酸組、肝臟代謝組測定，以探討PFOA、PFOS在發(fā)育關鍵期短期暴露對肝臟功能的影響。 結果 新生期、青春前期10mg/kg PFOA、1mg/kg和10mg/kg PFOS短期暴露，可引起雌鼠陰道開口時間比對照組早4-5天，提前進入青春期。新生期PFOA、PFOS暴露后，以非劑量依賴性的方式增加雌鼠體重和AGD；青春前期暴露也可增加雌鼠PND35的體重。在兩個暴露階段處理后，低、中劑量的PFOA、PFOS染毒組大鼠都能出現不規(guī)律的雌性周期，表現為延長的靜止期或發(fā)情后期。PND1-5和PND26-30暴露于PFOA、PFOS的雌鼠血清雌激素和LH水平上升，新生期對激素的影響強于青春前期。化合物染毒未引起卵巢組織結構發(fā)生明顯改變，但可影響卵泡數量，在新生期低劑量的PFOA、PFOS組大鼠可見生長卵泡數量減少。下丘腦前腹側室周核（AVPV）和弓狀核（ARC）區(qū)域Kiss1、Kiss1r、ERα的基因水平下降，免疫組化結果顯示kisspeptin纖維密度在PFOA、PFOS的高劑量暴露組受到抑制，與基因表達的結果趨勢大體相同。對于大鼠肝臟，高劑量組的PFOA、PFOS可以增加肝臟重量。GC-MS分析結果顯示，血清中多種脂肪酸的含量發(fā)生改變，肝臟代謝小分子分析顯示，PFOA、PFOS導致的差異表達物質主要集中在代謝通路、半乳糖代謝通路、脂肪酸合成通路等。 結論 新生期、青春前期短期暴露于環(huán)境劑量下的PFOA、PFOS能夠影響下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的調控，導致雌性青春期啟動的提前，其中kisspeptin/GPR54系統(tǒng)在其中起了關鍵作用。新生期暴露于PFOA、PFOS也可影響體內脂肪酸代
【關鍵詞】：報告基因 ER AR TR PPAR H295R類固醇合成試驗 類固醇激素 激素合成關鍵基因 SF-1 斑馬魚胚胎短期暴露試驗 斑馬魚表達譜芯片 青春期 陰道開口 Kisspeptin/GPR54 肝臟 代謝
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要5-11
• Abstract11-19
• 序言19-24
• 第一部分 體外試驗篩選 PFOA、PFOS 的內分泌干擾活性24-56
• 第一節(jié) PFOA、PFOS 對激素受體的干擾活性24-38
• 前言24-25
• 材料與方法25-30
• 結果30-35
• 討論35-38
• 第二節(jié) PFOA、PFOS 對類固醇激素合成的影響38-56
• 前言38-39
• 材料與方法39-49
• 結果49-53
• 討論53-56
• 第二部分 體內試驗研究 PFOA、PFOS 的內分泌干擾效應56-120
• 第一節(jié) PFOA、PFOS 對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響56-77
• 前言56-57
• 材料與方法57-62
• 結果62-74
• 討論74-77
• 第二節(jié) PFOA、PFOS 對大鼠青春期發(fā)育的影響77-120
• 前言77-79
• 材料與方法79-89
• 結果89-113
• 討論113-120
• 主要創(chuàng)新點120-121
• 參考文獻121-135
• 綜述135-177
• 參考文獻168-177
• 附錄177-183
• 致謝183-184

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1 金一和,舒為群,丁梅,翟成,齊藤憲光,佐佐木和明,安部隆司;兩地區(qū)一般人群血清中PFOS和PFOA污染特征比較[J];毒理學雜志;2005年S1期

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5 王麗君;班金豹;萬延建;沈杰;李媛媛;黃畦;;雌鼠全氟辛烷磺酸暴露對仔鼠DNA甲基化影響[J];中國公共衛(wèi)生;2011年03期

6 范軼歐,金一和,麻懿馨,張穎花,張曉

本文編號：294454