本文關(guān)鍵詞：黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相關(guān)基因功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《廣西大學》 2015年

黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相關(guān)基因功能分析

李培謙  

【摘要】：黃瓜枯萎病(Cucumber Fusarium Wilt)是黃瓜生產(chǎn)上嚴重的土傳真菌病害。這種土傳真菌能夠在各種不同類型的土壤中存活并導致植株發(fā)病,病害一旦發(fā)生,往往會給黃瓜的質(zhì)量與產(chǎn)量造成嚴重的損失。黃瓜枯萎病菌是尖孢鐮刀菌黃瓜�；�(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)。關(guān)于尖孢鐮刀菌的致病機理方面已有很多報道,主要包括導管堵塞假說、毒素作用假說、細胞壁降解等。但是由于對病原菌生物學特性認知的局限性,目前的研究還沒有完全闡明黃瓜枯萎病菌的致病機理,因此對黃瓜枯萎病的防治仍然沒有非常行之有效的措施。生物膜(biofilm)是微生物聚集在一起,附著在生物或者非生物的表面,并包埋在自身分泌的胞外物質(zhì)里,與浮游狀態(tài)相對的一種存在形式。生物膜的形成是人體、動物病原菌致病的關(guān)鍵因素。受人體角膜炎病原菌(Fusarium oxysporum)能夠形成生物膜并參與致病的啟發(fā),本研究探索黃瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cucumerinum)Foc-GD生物膜的形成與致病性的關(guān)系。主要開展生物膜形成條件的摸索、生物膜特性的分析、生物膜調(diào)控基因的挖掘及功能驗證等方面的研究。主要取得以下結(jié)果：1、黃瓜枯萎病菌Foc-GD生物膜的形成方法及條件。研究發(fā)現(xiàn),用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸黃瓜枯萎病菌Foc-GD孢子至106cfu/mL,將200μL標準的孢子懸浮液添加至平底96孔聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板的每孔內(nèi),將細胞培養(yǎng)板置于28℃C培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2h,用微量洗滌器將培養(yǎng)基及沒有黏附到培養(yǎng)板的孢子輕輕吸取,用PBS輕柔地漂洗兩次,最后粘附在細胞培養(yǎng)板表面的是生物膜的初始菌落,然后添加200μL RPMI 1640培養(yǎng)基于細胞培養(yǎng)板每個孔內(nèi)繼續(xù)靜置培養(yǎng)48h,至生物膜成熟。采用XTT(3,3'-[1-(苯氨�；�)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉)減低法對生物膜進行半定量測定。結(jié)果顯示,黃瓜枯萎病菌生物膜形成與培養(yǎng)基pH值、碳源和培養(yǎng)溫度有關(guān)。生物膜形成最適溫度是28℃,最適pH環(huán)境為微酸和中性環(huán)境(pH5-7),葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中能夠形成生物膜。2、病原菌Foc-GD生物膜特性分析。黃瓜枯萎病菌形成的生物膜用熒光染料染色后,借助激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜微觀結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)Foc-GD形成的成熟生物膜由濃密的菌絲細胞和胞外多糖分泌物組成,菌絲細胞與胞外多糖物質(zhì)緊密排列,形成質(zhì)地均一的復合體。成熟生物膜與浮游孢子相比,表現(xiàn)出對外界環(huán)境壓力不敏感型。研究發(fā)現(xiàn),在45℃的亞致死溫度下,處理30 min和min,成熟生物膜的代謝活動無明顯影響,而浮游孢子代謝活動分別降低了62.25%和86.29%。成熟生物膜與浮游孢子在-20℃,-10℃,4℃下處理24h,浮游孢子與成熟生物膜在4℃下代謝活動沒有明顯差異,而-20℃,-10℃的低溫對成熟生物膜的影響明顯小于對浮游孢子的影響。樣品在紫外線下處理20min,30min后,成熟生物膜分別下降了29.18%、43.11%,而浮游孢子卻下降了52.29%、90.23%。用6.4μg/mL的多菌靈、咪酰胺、丙環(huán)唑分別處理樣品24h之后,成熟生物膜的代謝活動分別下降了33.8%、39.2%和26.6%,而浮游孢子分別下降了76.5%、73.2%、50.7%。3、病原菌Foc-GD絲絨蛋白基因FocVell的克隆與表達。研究表明,絲絨蛋白FocVell(GenBank:KJ716229)編碼532個氨基酸,最大開放閱讀框為1596bp,含有1個94bp的內(nèi)含子。將FocVell氨基酸序列比對,分別與F.fujikuroi的FjVell (GenBank: FN548142), F. verticillioides的FvVel (GenBank:DQ274059), F. graminearum的FgVEA from (GenBank:JN635273)具有97.56%,97.74%,78.29%的相似性。借助實時熒光定量PCR分析FocVell在野生型Foc-GD菌絲發(fā)育的24,36,48,60,72h表達情況。FocVell在菌絲發(fā)育的24和36h,表達量較低(p0.05)；在48h,達到高峰,在60和72h,表達量相對降低并穩(wěn)定保持較高水平(p0.05)。FocVell的表達結(jié)果與文獻報道黃瓜枯萎病菌分生孢子梗在48h之后增殖的結(jié)果是一致的。4、黃瓜枯萎病原菌絲絨蛋白基因FocVell的功能驗證。利用基因敲除與回補的方法研究FocVell的功能。研究發(fā)現(xiàn),絲絨蛋白FocVell基因具有調(diào)控病原菌孢子發(fā)育、菌絲生長、細胞壁組分、生物膜形成與致病性的作用。用馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株,FocVell敲除突變體△FocVell-3產(chǎn)孢量遠遠小于野生型菌株Foc-GD和回補突變體△FocVell-3C(p 0.05),△FocVell-3菌落生長明顯變慢,氣生菌絲變少變短,并且菌絲分支明顯增多。分別用1.0 M KCl、1.0 M山梨醇、16 μg/mL異菌脲、0.2 μg/mL咪鮮胺、48μg/mL惡霉靈、0.05%剛果紅、5mM咖啡堿添加至培養(yǎng)基,研究菌落對滲透壓力與細胞破壞劑的敏感性。研究發(fā)現(xiàn),△Foc Vell-3對1.0 M KCl、1.0 M山梨醇、0.05%剛果紅、5 mM咖啡堿的敏感性下降(p0.05),對16 μg/mL異菌脲、0.2 μg/mL咪鮮胺的敏感性上升(p0.05),結(jié)果表明Focvell可能與細胞壁的組成、細胞壁的完整性有關(guān)。生物膜形成比較發(fā)現(xiàn),在聚苯乙烯片上,突變體△FocVell-3孢子在聚苯乙烯板上的聚集減少,而且孢子萌發(fā)和菌絲的生長延遲,△FocVell-3形成的生物膜比較稀薄,比較松散,菌絲與胞外物質(zhì)分布不均。XTT半定量法測定顯示野生型Foc-GD和回補型菌株△FocVell-3C成膜的量分別是基因敲除突變菌株△FocVell-3的1.23,1.52,1.69,2.56倍。用突變體△FocVell-3與野生型Foc-GD、回補型△FocVell-3C接種黃瓜苗,15天后,接種野生型Foc-GD和回補型△FocVell-3C的黃瓜苗逐漸發(fā)病并枯萎死亡,病情指數(shù)DSI分別為93.7和92.3,而接種FocVell基因敲除突變菌株△FocVell-3的黃瓜苗發(fā)病率明顯下降,多數(shù)黃瓜苗只出現(xiàn)輕微黃化癥狀,病情指數(shù)DSI為37.3(p0.05)。結(jié)果表明FocVell基因與黃瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp. cucumerinum生物膜形成及致病力有關(guān)。5、黃瓜枯萎病菌轉(zhuǎn)化GFP載體。借助激光共聚焦顯微鏡觀察到在接種病原菌孢子懸浮液24h后,孢子不斷萌發(fā)并粘附到黃瓜苗側(cè)根的表面,隨著接種時間的延長,病原菌逐漸刺穿側(cè)根表皮,進入表皮細胞。侵染進展期,病原菌侵入主根表皮,并不斷向維管束部分侵染,接種120h之后,即侵染后期,病原菌占據(jù)主根維管束部位,菌絲逐漸密集成交錯菌絲網(wǎng)。本研究中黃瓜枯萎病菌Foc-GD FocVell基因敲除后,生物膜的形成受損,致病力下降,表明生物膜的形成是植物病原真菌重要的致病因子,該研究結(jié)果為揭示黃瓜枯萎病的致病機理提供新思路,對黃瓜枯萎病的綜合防控提供理論支持。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S436.421.13
【目錄】：

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4 王娟;抗生素鎖技術(shù)治療中心靜脈導管相關(guān)感染的實驗室研究[D];長江大學;2015年

5 尼逸倫;池塘生物膜低碳養(yǎng)殖新模式應用研究[D];集美大學;2015年

6 尹正國;脫管散體外抗銅綠假單胞菌生物膜作用的研究[D];甘肅中醫(yī)藥大學(原名：甘肅中醫(yī)學院);2015年

7 董麗紅;棉花根系分泌物對枯草芽胞桿菌NCD-2菌株生物膜形成的影響[D];河北農(nóng)業(yè)大學;2015年

8 謝冰涵;低溫對MFC產(chǎn)電性能及陽極生物膜群落結(jié)構(gòu)影響的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2015年

9 翟振;LEA蛋白特征重復片段對POPE生物膜的干燥保護活性研究[D];上海理工大學;2015年

10 劉慧娜;給水管網(wǎng)管壁生物膜微生物多樣性研究[D];天津大學;2007年

  本文關(guān)鍵詞：黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相關(guān)基因功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：245672