【摘要】 石油是重要的一次能源之一,其應(yīng)用范圍不斷拓展,在其開采、儲(chǔ)運(yùn)和使用過(guò)程中無(wú)法避免地會(huì)有泄油事故發(fā)生,造成上壤及水體的嚴(yán)重污染。石油類污染物具有較高的生物學(xué)毒性,進(jìn)入環(huán)境后較難降解、消除,從而對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成極大的危害。由于微生物能夠通過(guò)多種多樣的代謝途徑降解石油污染物,因此在石油污染物的治理中多采用生物法去除,此法見效快且成本低,在環(huán)境凈化領(lǐng)域起到關(guān)鍵的作用。本文研究了一株二苯并呋喃(Dibenzofuran, DF)降解菌Rhodococcus sp.strain p52對(duì)不同鏈長(zhǎng)的烷烴和芳香烴的降解性能。Rhodococcus sp. strain p52以利用直鏈烷烴(正十四烷、正二十四烷和正三十二烷)、支鏈烷烴(異十九烷)和芳香烴(萘和菲)等化合物作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)。經(jīng)48h培養(yǎng)后,85.7%的正十四烷被降解,比降解速率達(dá)到3.8mg h-1g-1；在9-11天內(nèi),79.4%的正二十四烷、66.4%的正三十二烷、63.9%的異十九烷、接近100%的萘和55.3%的菲被降解,比降解速率分別達(dá)到20.5、14.7、20.3、16和12.9mg day-1g-1.通過(guò)分析各種烴的代謝產(chǎn)物得出,Rhodococcus sp. strain p52通過(guò)單末端、雙末端和亞末端氧化的方式起始十四烷的降解；通過(guò)亞末端氧化的方式起始異十九烷的降解；通過(guò)單加氧方式起始萘的代謝,而通過(guò)單加氧和雙加氧方式起始菲的代謝。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到編碼烷烴羥化酶的基因序列,包括CYP185家族的細(xì)胞色素P450酶的基因和兩個(gè)烷烴單加氧酶基因,將上述核酸序列測(cè)序分析后,與核酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)的酶進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)這些基因序列與其他已報(bào)道的革蘭氏陽(yáng)性菌中相應(yīng)序列有較高的同源性,但兩個(gè)單加氧酶AlkB-1和AlkB-2的氨基酸序列之間同源性僅有62%。這些基因在上述各石油烴化合物存在時(shí)的表達(dá)狀況經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證,上述羥化酶基因的功能也通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。此外,研究表明與芳香化合物降解相關(guān)的降解質(zhì)粒pDF01和pDF02具有同屬和屬間接合遷移性,經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng),質(zhì)粒pDF01和pDF02具有較好的遺傳穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明,Rhodococcus sp. strain p52對(duì)石油污染物的生物修復(fù)具有較大的應(yīng)用潛力。 

第一章前言

石油類化合物是環(huán)境中危害嚴(yán)重、污染周期長(zhǎng)的工業(yè)污染物。在石油開釆、儲(chǔ)運(yùn)、加工和使用過(guò)程中不可避免地會(huì)有池漏油事故發(fā)生，對(duì)水體、土壤、大氣環(huán)境及人類的生活造成了難以估量的損失。由于石油污染多由事故性或含油廢水的大量排放引起，污染物質(zhì)總量大，超出了污染區(qū)域生態(tài)環(huán)境的自凈能力，一旦進(jìn)入環(huán)境，難徹底清除。石油污染物具有較強(qiáng)的生物學(xué)毒性，可致癌、致畸、致突變，其中芳香烴類化合物對(duì)人和動(dòng)物的毒性較大，尤其是以雙環(huán)和三環(huán)為代表的多環(huán)芳烴毒性更大，已確認(rèn)其具有較強(qiáng)的致癌作用，可以通過(guò)呼吸、皮膚接觸、飲食攝入等方式進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)，能溶解細(xì)胞膜，干擾酶系統(tǒng)，影響肝、腎等器官的正常功能，甚至引發(fā)癌變⑴。其中某些化合物還能夠通過(guò)生物富集作用累積，為其他生物的生存和人類的健康埋下隱患。近些年來(lái)，隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)及釆礦業(yè)的不斷發(fā)展以及新技術(shù)、新材料的不斷開發(fā)引進(jìn)，使得大量化學(xué)污染物，特別是人工合成化合物進(jìn)入環(huán)境，使環(huán)境中的污染物變得更加復(fù)雜。由于這些化合物本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使其治理難度加大，在短時(shí)間內(nèi)不能被有效清除，致使在環(huán)境中的存留時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年至數(shù)十年，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成極大危害，嚴(yán)重地影響著人類的健康。因此必須尋求處理時(shí)間更快、處理效率更高的方法進(jìn)行治理。石油污染的修復(fù)技術(shù)主要包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、物理化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。
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第二章Rhodococcu sp.strain  p52對(duì)直鏈燒經(jīng)的降解

2.1材料與方法
菌株活化及培養(yǎng)：取出保存于-70度冰箱中的菌株甘油保藏管一支，劃線接種于平板上，于30度溫箱中培養(yǎng)20h后，挑取紅球菌p52單菌落接種于10Ml LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h。按1%接種量分別接種到兩個(gè)含300ml液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，恒溫震蕩培養(yǎng)，最后將其中一份菌體置于105度烘箱中供干直至質(zhì)量不再發(fā)生變化，計(jì)算出細(xì)胞干重；將另—份菌體重新懸浮于中用于CFMM降解實(shí)驗(yàn)。

2.2結(jié)果與討論
在只含菌液不含底物的對(duì)照組中，細(xì)胞的生長(zhǎng)量基本無(wú)增加。在以各直鏈烷輕（正十四燒、正二十四燒和正三十二燒）為唯一碳源及能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，Rhodococcu sp.strain  p52菌體的生長(zhǎng)伴隨著對(duì)各直鏈焼烴的消耗，由于實(shí)驗(yàn)中所用的烴類都不溶于水，在各烴的降解初期，細(xì)胞與底物之間的接觸受限，妨礙了底物的代謝速度，使得菌體生長(zhǎng)速度緩慢。盡管如此，與無(wú)菌對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組對(duì)中長(zhǎng)鏈直鏈燒烴的降解仍非常明顯，尤其是對(duì)正十四燒的降解，經(jīng)48h培養(yǎng)后，正十四焼的濃度由177.5mg/l下降到25.3mg/l，Rhodococcu sp.strain  p52對(duì)難降解的長(zhǎng)鏈燒烴（正二十四燒和正三十二燒）也表現(xiàn)出了較好的降解能力，培養(yǎng)11d后對(duì)它們的降解率分別達(dá)到了79.4%和66.4%。

第三章Rhodococcu sp.strain  p52對(duì)支鏈燒烴的降解............21
3.1材料與方法...........21
3.2結(jié)果與討論...............22
3.3小結(jié)......................25
第四章Rhodococcu sp.strain  p52對(duì)芳香烴的降解..................27
4.1材料與方法................27
4.2結(jié)果與討論.....................28
4.3小結(jié)............30
第五章石油烴降解基因的擴(kuò)增及其轉(zhuǎn)錄活性分析..............31
5.1材料與方法............31
5.2結(jié)果與討論...........34
5.3小結(jié).......................37

第七章降解質(zhì)粒PdF01和PdF02的接合遷移性和穩(wěn)定性分析

7.1材料與方法
主要試劑
抗生素：氯霉素，鏈霉素，卡那霉素，土霉素，四環(huán)素，金霉素，紅霉素，慶大霉素，強(qiáng)力霉素，購(gòu)自上海生工生物。本章Rhodococcu sp.strain  p52以為供體菌，以與紅球菌親緣關(guān)系較近的同屬或不同屬微生物為受體菌，采用濾膜接合法進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)。通過(guò)接合實(shí)驗(yàn)研究降解質(zhì)粒從供體菌向不同受體菌中遷移的能力及其遷移的宿主范圍。通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)，考察質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性。

7.2結(jié)果與討論
Rhodococcu sp.strain  p52對(duì)所有測(cè)試抗生素的抗性均不明顯，紫紅紅球菌、地桿菌、大地兩面神菌對(duì)鏈霉素有明顯抗性，紅串紅球菌、蠟樣芽孢桿菌對(duì)卡那霉素有明顯抗性，銅綠假單胞菌對(duì)氯霉素有抗性，枯草芽孢桿菌對(duì)強(qiáng)力霄素有抗性，腫大地桿菌、金色節(jié)桿菌對(duì)所有測(cè)試抗生素的抗性均不明顯。質(zhì)粒不穩(wěn)定的類型包括質(zhì)粒分離不穩(wěn)定和質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性是指由于在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生的質(zhì)粒的不平均分配而造成的質(zhì)粒丟象現(xiàn)象；質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性是指由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒的重排和缺失。因此，質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳需要兩個(gè)必要條件：一是平均每個(gè)世代每個(gè)質(zhì)粒至少發(fā)生一次復(fù)制；二是細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制產(chǎn)生的質(zhì)�？截惐仨毱骄峙涞絻蓚�(gè)子細(xì)胞中去。由于時(shí)間的限制本章的研究主要涉及質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性，尚有待于進(jìn)一步針對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性開展研究。
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第八章結(jié)論與建議

本研究以一株二苯并咲喃降解菌Rhodococcu sp.strain  p52為研究對(duì)象，研究了其對(duì)不同鏈長(zhǎng)的燒烴和芳香烴的降解性能；克隆分析了Rhodococcu sp.strain  p52中與石油化合物降解相關(guān)的經(jīng)化酶基因序列并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄驗(yàn)證了每種單加氧酶在不同降解底物存在時(shí)的表達(dá)活性。通過(guò)構(gòu)建輕化酶基因的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，驗(yàn)證了各降解基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化烴的功能。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)各石油化合物的降解特征，收集各化合物的主要代謝產(chǎn)物，歸納了燒烴和芳香烴可能的降解途徑�？疾炝薘hodococcu sp.strain  p52中降解質(zhì)粒在同屬菌株或?qū)匍g接合遷移性及其遺傳穩(wěn)定性。得到的主要結(jié)論如下：通過(guò)對(duì)各烴代謝產(chǎn)物及代謝途徑分析推測(cè)Rhodococcu sp.strain  p52通過(guò)單末端、雙末端和亞末端氧化的方式起始十四燒的降解；通過(guò)亞末端氧化的方式起始異十九燒的降解；通過(guò)單加氧方式起始萘的代謝，通過(guò)單加氧和雙加氧方式起始菲的代謝。

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本文編號(hào)：10946