雞γ干擾素(Chicken interferon-gamma, ChIFN-γ)具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用,作為生物藥劑和疫苗佐劑具有廣闊的應(yīng)用前景。正常情況下,機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ的數(shù)量很有限,一定程度上限制了IFN-γ的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)主要采用重組DNA和基因表達(dá)技術(shù),通過RT-PCR方法成功克隆雞IFN-γ基因,并對其基因序列進(jìn)行了分析,旨在為大量制備和生產(chǎn)高效廉價(jià)的雞IFN-γ及其體外大量表達(dá)作好準(zhǔn)備。在體外雞IFN-γ生物學(xué)活性研究基礎(chǔ)上,聯(lián)合禽流感滅活疫苗免疫研究機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng),對雞IFN-γ的免疫增強(qiáng)作用進(jìn)行了研究。 根據(jù)GenBank發(fā)表的ChIFN-γ基因序列,設(shè)計(jì)了一對引物,采用RT-PCR方法,從激活的脾臟淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出ChIFN-γ基因序列。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增出的片段約為495 bp。經(jīng)過雙酶切、PCR鑒定和測序結(jié)果顯示,克隆的ChIFN-γ基因與GenBank發(fā)表的雞IFN-γ基因序列同源性為99.8%。將擴(kuò)增的ChIFN-γ克隆至原核表達(dá)載體pET30a上,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-ChIFN-γ。將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 禽流感概述
        1.1.1 禽流感流行現(xiàn)狀
        1.1.2 禽流感病毒分子生物學(xué)特征
        1.1.3 基因組的結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的功能
        1.1.4 禽流感疫苗
    1.2 干擾素概述
        1.2.1 IFN 分類及性質(zhì)
        1.2.2 IFN-γ產(chǎn)生及誘導(dǎo)劑
        1.2.3 IFN-γ生物學(xué)活性
        1.2.4 IFN-γ的應(yīng)用
    1.3 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 病毒株
        2.1.3 細(xì)胞株、菌株及載體
        2.1.4 主要工具酶、抗體及分子生物學(xué)試劑盒
        2.1.5 主要生化試劑
        2.1.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 雞脾淋巴細(xì)胞總RNA 分離
        2.2.2 雞IFN-γ基因RT-PCR 擴(kuò)增
        2.2.3 PCR 擴(kuò)增片段克隆
        2.2.4 重組質(zhì)粒鑒定
        2.2.5 雞IFN-γ基因重組表達(dá)載體構(gòu)建
        2.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定
        2.2.7 重組雞IFN-γ在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.8 融合蛋白純化
        2.2.9 免疫印記分析
        2.2.10 重組蛋白對VSV 感染細(xì)胞細(xì)胞病變的抑制
        2.2.11 多克隆抗體制備
        2.2.12 多克隆抗體鑒定
        2.2.13 重組雞γ干擾素對禽流感滅活苗的免疫增強(qiáng)效應(yīng)
    2.3 數(shù)據(jù)處理
3 試驗(yàn)結(jié)果
    3.1 雞 IFN-γ 基因克隆與序列測定
        3.1.1 雞脾淋巴細(xì)胞總RNA 分離
        3.1.2 RT-PCR 法擴(kuò)增雞IFN-γ基因序列
        3.1.3 重組質(zhì)粒pMD18-T-ChIFN-γ的鑒定
        3.1.4 ChIFN-γ序列測定及分析
    3.2 雞 IFN-γ 基因在大腸桿菌中的表達(dá)及多克隆抗體制備
        3.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定
        3.2.2 融合蛋白表達(dá)、鑒定與純化
        3.2.3 重組蛋白生物活性檢測
        3.2.4 多抗血清效價(jià)及特異性鑒定
    3.3 禽流感HI 抗體水平測定
    3.4 雛雞免疫器官及血液T、B 淋巴細(xì)胞增殖功能動(dòng)態(tài)變化
        3.4.1 雛雞胸腺T 淋巴細(xì)胞增殖功能動(dòng)態(tài)變化
        3.4.2 雛雞脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖功能動(dòng)態(tài)變化
        3.4.3 雛雞血液T 淋巴細(xì)胞增殖功能動(dòng)態(tài)變化
        3.4.4 雛雞脾臟B 淋巴細(xì)胞增殖功能動(dòng)態(tài)變化
        3.4.5 雛雞血液B 淋巴細(xì)胞增殖功能動(dòng)態(tài)變化
    3.5 雛雞免疫器官及血液不同亞型T 淋巴細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)變化
        3.5.1 雛雞免疫器官及血液CD4⁺ T 淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化
        3.5.2 雛雞免疫器官及血液CD8⁺ T 淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化
    3.6 雛雞體重增長測定
    3.7 免疫器官指數(shù)測定
    3.8 禽流感病毒感染雛雞病理學(xué)觀察
    3.9 免疫攻毒保護(hù)率
4 討論
    4.1 雞 IFN-γ 基因克隆與表達(dá)
        4.1.1 雞IFN-γ基因克隆與序列
        4.1.2 雞IFN-γ基因表達(dá)、純化與生物活性
        4.1.3 多克隆抗體制備及鑒定
    4.2 ChIFN-γ 對禽流感滅活苗免疫增強(qiáng)效應(yīng)
        4.2.1 雛雞免疫后HI 抗體水平變化
        4.2.2 雛雞免疫后T、B 淋巴細(xì)胞增殖功能變化
        4.2.3 雛雞免疫后不同亞型T 細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)變化
        4.2.4 雛雞增重及免疫器官指數(shù)變化
        4.2.5 禽流感病毒攻擊雛雞病理學(xué)變化及免疫保護(hù)率
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3844559