發(fā)布時(shí)間：2017-09-12 14:26

  本文關(guān)鍵詞：啶蟲(chóng)脒講解菌株的分離、鑒定及腈水合酶基因的克隆與表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 啶蟲(chóng)脒 降解 生物修復(fù) 腈水合酶 激活蛋白 分子伴侶

【摘要】：啶蟲(chóng)脒是一種廣譜新煙堿類殺蟲(chóng)劑,也是一種新型的農(nóng)藥,現(xiàn)已經(jīng)被越來(lái)越多的國(guó)家投入使用,而我國(guó)啶蟲(chóng)脒的年產(chǎn)量已超過(guò)了5000噸。啶蟲(chóng)脒是一種具有一定殺螨活性的殺蟲(chóng)劑,其作用于土壤和枝葉的系統(tǒng)。廣泛用于水稻,尤其蔬菜、果樹(shù)、茶葉的蚜蟲(chóng)、飛虱、薊馬、部分鱗翅目害蟲(chóng)等的防治。但作為殺蟲(chóng)劑它仍具有低毒性,并且在生態(tài)系統(tǒng)中被廣泛的檢測(cè)到,在這個(gè)越來(lái)越重視生態(tài)的社會(huì)中,引起了廣泛的關(guān)注。啶蟲(chóng)脒污染的生物修復(fù)被認(rèn)為是一種有效、可靠和無(wú)再次污染的方法。因此,篩選高效降解啶蟲(chóng)脒的微生物菌種資源,探索其降解啶蟲(chóng)脒的作用機(jī)理,充分發(fā)揮其降解能力,具有重大的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究的意義在于分離、篩選高效降解啶蟲(chóng)脒的微生物菌株,并對(duì)菌株在不同環(huán)境條件下降解啶蟲(chóng)脒的特性進(jìn)行研究,以期為啶蟲(chóng)脒污染環(huán)境的修復(fù)提供理論依據(jù);同時(shí)克隆降解啶蟲(chóng)脒的關(guān)鍵酶基因,進(jìn)一步研究該降解酶的特性。本文通過(guò)富集培養(yǎng)的方法,從被啶蟲(chóng)脒污染的土樣中篩選出5株啶蟲(chóng)脒降解菌株,分別命名為22-5、DF-1、Y-3、DY-17、YF-20。選取其中降解啶蟲(chóng)脒效果最好的一株菌DY-17作為研究對(duì)象,通過(guò)革蘭氏染色及在電鏡下的照片確定其為一株革蘭氏陰性的桿菌。采用SDS高鹽法從啶蟲(chóng)脒降解菌DY-17中提取高質(zhì)量的染色體總DNA,作為模板通過(guò)16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析初步鑒定為Pseudomonas sp.中的一個(gè)新成員,并根據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。對(duì)啶蟲(chóng)脒降解菌DY-17的生理特性進(jìn)行研究,得出啶蟲(chóng)脒降解菌株DY-17降解活性的最適條件為:37℃,pH為7,啶蟲(chóng)脒濃度為200 mg/L;該研究結(jié)果為啶蟲(chóng)脒污染環(huán)境的生物修復(fù)提供了菌種資源。將所提取的細(xì)菌總DNA,建立基因組文庫(kù)。約從12000個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選出了一個(gè)具有啶蟲(chóng)脒降解活性的陽(yáng)性克隆子。用軟件分析確定了其為腈水合酶結(jié)構(gòu)基因。將啶蟲(chóng)脒的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因和腈水合酶結(jié)構(gòu)基因下游的激活蛋白連接到表達(dá)載體pET29a上,再分別將腈水合酶和腈水合酶與激活蛋白轉(zhuǎn)化到Ecoli.BL21(DE3)表達(dá);進(jìn)行SDS-PAGE分析,從電泳圖我們獲得了腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的α亞基大小為26 kDa,β亞基大小為25 kDa,激活蛋白分子大小為48kDa。從實(shí)驗(yàn)中我們可以得出:啶蟲(chóng)脒降解菌株腈水合酶基因單獨(dú)表達(dá)時(shí)活性較低,以可溶性表達(dá)的量比較少,酶的活性較弱;當(dāng)與激活蛋白共表達(dá)時(shí),以可溶性表達(dá)的量增加,酶的活性增強(qiáng),說(shuō)明激活蛋白可能起著類似分子伴侶的作用,幫助腈水合酶正確折疊,形成有功能的空間構(gòu)象。這將為新煙堿類殺蟲(chóng)劑污染的微生物修復(fù)提供基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：啶蟲(chóng)脒 降解 生物修復(fù) 腈水合酶 激活蛋白 分子伴侶
【學(xué)位授予單位】：淮北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X592;X172
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 啶蟲(chóng)脒及其在環(huán)境中的代謝轉(zhuǎn)化12-18
• 1 啶蟲(chóng)脒的主要物理化學(xué)性質(zhì)及其用途12-13
• 2 啶蟲(chóng)脒的作用機(jī)制13
• 3 啶蟲(chóng)脒的性能特點(diǎn)13-14
• 4 啶蟲(chóng)脒的殘留14
• 5 啶蟲(chóng)脒在環(huán)境中的代謝轉(zhuǎn)化14-16
• 5.1 啶蟲(chóng)脒的光解14-15
• 5.2 啶蟲(chóng)脒的水解15-16
• 5.3 啶蟲(chóng)脒在土壤中的降解16
• 6 啶蟲(chóng)脒微生物降解研究存在的問(wèn)題及發(fā)展的方向16-18
• 第二章 啶蟲(chóng)脒降解菌株的分離、鑒定及其生理特性研究18-39
• 第一節(jié) 啶蟲(chóng)脒降解菌株的分離與鑒定18-32
• 1 材料與方法18-26
• 1.1 菌株、培養(yǎng)基、試劑與儀器18-19
• 1.2 啶蟲(chóng)脒檢測(cè)方法的測(cè)定19-20
• 1.3 啶蟲(chóng)脒降解菌株的分離與篩選20
• 1.4 降解菌株的革蘭氏染色20-21
• 1.5 降解菌株的抗性篩選21-22
• 1.6 啶蟲(chóng)脒降解菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定22
• 1.7 啶蟲(chóng)脒降解菌株 16S r RNA基因序列的分析22-25
• 1.8 啶蟲(chóng)脒降解菌株 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增25
• 1.9 啶蟲(chóng)脒降解菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建25-26
• 2 結(jié)果與分析26-31
• 2.1 啶蟲(chóng)脒檢測(cè)方法的測(cè)定26-27
• 2.2 啶蟲(chóng)脒降解菌株的分離與篩選27-28
• 2.3 啶蟲(chóng)脒降解菌株的初步鑒定28-29
• 2.4 革蘭氏染色結(jié)果29
• 2.5 啶蟲(chóng)脒降解菌株的抗性篩選29-30
• 2.6 啶蟲(chóng)脒降解菌株的 16s rRNA基因序列的分析30-31
• 3 小結(jié)31-32
• 第二節(jié) 啶蟲(chóng)脒降解特性研究32-39
• 1 材料與方法32-35
• 1.1 培養(yǎng)基與菌株32
• 1.2 主要試劑和儀器32-33
• 1.3 生長(zhǎng)曲線及降解測(cè)定33
• 1.4 溫度對(duì)菌株DY-17降解率的影響33
• 1.5 初始pH值對(duì)菌株DY-17降解率的影響33
• 1.6 培養(yǎng)液初始農(nóng)藥濃度對(duì)菌株DY-17降解率的影響33-34
• 1.7 金屬離子對(duì)菌株DY-17降解率的影響34-35
• 2 結(jié)果與分析35-38
• 2.1 菌株DY-17的生長(zhǎng)和降解曲線35-36
• 2.2 溫度對(duì)菌株DY-17降解率的影響36
• 2.3 初始pH對(duì)菌株DY-17降解率的影響36-37
• 2.4 培養(yǎng)液初始農(nóng)藥濃度對(duì)菌株DY-17降解率的影響37-38
• 2.6 金屬離子對(duì)菌株DY-17降解率的影響38
• 3 小結(jié)38-39
• 第三章 啶蟲(chóng)脒腈水合酶的克隆與表達(dá)39-67
• 第一節(jié) 啶蟲(chóng)脒腈水合酶基因的克隆與表達(dá)40-58
• 1 材料與方法40-49
• 1.1 菌株及質(zhì)粒40
• 1.2 試劑40
• 1.3 培養(yǎng)基40-41
• 1.4 超級(jí)感受態(tài)的制備41-43
• 1.5 細(xì)菌總DNA的提取43
• 1.6 質(zhì)粒DNA的少量提取43
• 1.7 基因組總DNA的Sau3AI部分酶切與片段回收43-44
• 1.8 酶連44-45
• 1.9 酶連產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化45
• 1.10 陽(yáng)性克隆子的篩選45
• 1.11 序列測(cè)定45
• 1.12 基因序列的比較與分析45
• 1.13 啶蟲(chóng)脒腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的PCR擴(kuò)增45-46
• 1.14 啶蟲(chóng)脒腈水合酶表達(dá)載體的構(gòu)建46-47
• 1.15 啶蟲(chóng)脒腈水合酶的SDS-PAGE分析47-49
• 2 結(jié)果與分析49-57
• 2.1 Sau3AI部分酶切49
• 2.2 菌株DY-17總DNA文庫(kù)的構(gòu)建49-50
• 2.3 陽(yáng)性克隆子的篩選50-51
• 2.4 基因序列的測(cè)定及分析51-53
• 2.5 結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)53-57
• 3 討論57-58
• 第二節(jié) 激活蛋白的克隆與腈水合酶及其激活蛋白共表達(dá)58-67
• 1 材料與方法58-62
• 1.1 菌株及質(zhì)粒58
• 1.2 試劑58-59
• 1.3 培養(yǎng)基59
• 1.4 啶蟲(chóng)脒腈水合酶的激活蛋白結(jié)構(gòu)基因的PCR擴(kuò)增59-60
• 1.5 啶蟲(chóng)脒腈水合酶的激活蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建60
• 1.6 表達(dá)60-62
• 2 結(jié)果與分析62-66
• 2.1 啶蟲(chóng)脒腈水合酶激活蛋白結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增及分析62
• 2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建62-63
• 2.3 啶蟲(chóng)脒腈水合酶激活蛋白結(jié)構(gòu)基因在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE分析63-64
• 2.4 啶蟲(chóng)脒腈水合酶結(jié)構(gòu)基因及其激活蛋白結(jié)構(gòu)共表達(dá)的SDS-PAGE分析64-65
• 2.5 啶蟲(chóng)脒腈水合酶及其激活蛋白共表達(dá)質(zhì)粒的功能驗(yàn)證65-66
• 3 討論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 附錄72-77
• 攻讀碩士學(xué)位期間出版或發(fā)表的論著、論文77-78
• 致謝78

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本文編號(hào)：837775