本文關鍵詞：桔小實蠅保幼激素信號通路Met和Kr-h1基因功能初探

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【摘要】：桔小實蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)隸屬雙翅目Diptera、實蠅科Tephritidae,廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。由于極強的環(huán)境適應和擴散入侵能力,桔小實蠅被多個國家和地區(qū)列為檢疫性害蟲,對國際貿易造成了諸多限制;同時由于其寄主范圍廣、繁殖力強、造成的經濟損失嚴重,因此該蟲是果蔬上的危險性害蟲。桔小實蠅一生經歷卵、幼蟲、蛹、成蟲四個發(fā)育階段,其成蟲將卵產于果皮之下,幼蟲孵化后取食果肉,造成果實脫落或失去經濟價值。變態(tài)發(fā)育作為桔小實蠅重要的生理過程,具有重要的研究意義。在昆蟲中,蛻皮激素和保幼激素協(xié)同作用,共同參與調控昆蟲的蛻皮和變態(tài)發(fā)育。相對于蛻皮激素信號通路,保幼激素(Juvenile hormone,JH)分子作用機制還遠未清楚。本學位論文基于桔小實蠅基因組及轉錄組數據庫信息,運用RT-PCR技術,從桔小實蠅體內克隆獲得了JH信號通路基因Met和Kr-h1的開放閱讀框(ORF),并對其特征序列進行了注釋;利用qPCR技術解析了桔小實蠅Met和Kr-h1的時空表達模式,同時明確和記錄了外源激素(JH III和烯蟲酯Methoprene)處理后桔小實蠅幼蟲及蛹的應激表達模式及其表型變化;在此基礎上,利用RNAi探索了Met和Kr-h1在桔小實蠅變態(tài)發(fā)育過程中的功能。研究結果不僅有助于了解昆蟲生長發(fā)育機理,還有利于尋找新的殺蟲靶標,為實蠅類害蟲的持續(xù)防控提供新的思路和方法。主要研究結果如下:1桔小實蠅JH信號通路Met和Kr-h1基因的克隆與序列分析基于桔小實蠅基因組和轉錄組數據庫,克隆獲得了JH信號通路Met和Kr-h1基因的ORF,并推導了其編碼的氨基酸序列。進一步利用Scanprosite、NetNGlyc1.0、SignalP 4.1以及TMHMM等生物信息學軟件分析了Met、Kr-h1基因推導的蛋白質的保守序列、跨膜結構等潛在的生理功能。2桔小實蠅JH信號通路Met和Kr-h1基因的時空表達模式2.1桔小實蠅JH信號通路Met和Kr-h1基因在不同發(fā)育階段的表達模式利用qPCR技術解析了JH信號通路Met、Kr-h1基因在桔小實蠅卵、幼蟲、蛹及成蟲1日齡的mRNA表達模式。結果表明,Met基因在桔小實蠅整個發(fā)育階段持續(xù)表達,但幼蟲期的表達量明顯高于蛹期。幼蟲期呈現(xiàn)不規(guī)律的波浪形起伏,在末齡期的第9日齡達到高峰,之后在蛹期持續(xù)低表達,推測該基因在桔小實蠅變態(tài)發(fā)育的過程中起著重要作用。Kr-h1基因變化更為顯著,其在卵期有較高的相對表達量,而在幼蟲第3、4日齡有明顯的下調現(xiàn)象,在進入3齡幼蟲期的第5日齡開始出現(xiàn)持續(xù)上調直至蛹期第1日齡,同樣在即將化蛹的幼蟲第9日齡出現(xiàn)高峰。此外,Met、Kr-h1基因均在蛹-成蟲的轉變過程中出現(xiàn)上調。Kr-h1基因在響應桔小實蠅JH變化過程中發(fā)揮了極大的作用,是桔小實蠅變態(tài)發(fā)育的重要調控因子。2.2桔小實蠅JH信號通路Met和Kr-h1基因在幼蟲不同組織的表達模式利用qPCR技術解析了JH信號通路Met、Kr-h1基因在桔小實蠅3齡幼蟲脂肪體、馬氏管、中腸、氣管和表皮組織中的表達模式。結果表明,2個基因均在桔小實蠅幼蟲馬氏管中表達量最高,其次為脂肪體,而分別在幼蟲氣管、中腸中表達量最低。3 JH III和Methoprene對桔小實蠅Met和Kr-h1基因表達的影響3.1 JH III和Methoprene對桔小實蠅幼蟲Met和Kr-h1基因表達的影響利用點滴法分別對桔小實蠅4日齡幼蟲施用JH III和Methoprene。于處理后的6 h、10 h和24 h,分別檢測桔小實蠅Met、Kr-h1基因的表達量。qPCR結果表明,兩種化合物均對Met基因無明顯的刺激作用;兩種激素處理后的24 h,Kr-h1基因表達量均出現(xiàn)顯著性上調,最終導致幼蟲在化蛹后形態(tài)上出現(xiàn)了介于幼蟲和蛹之間的“中間形態(tài)”。此外,相對JH III,Kr-h1基因對Methoprene更敏感。3.2 JH III和Methoprene對桔小實蠅蛹Met和Kr-h1基因表達的影響利用點滴法分別對桔小實蠅初蛹(12 h)施用JH III和Methoprene。于處理后的1 d、3 d、5 d、7 d,分別檢測桔小實蠅Met和Kr-h1基因的表達量。qPCR結果表明,兩種激素處理對Met基因表達量無顯著影響;而Kr-h1基因表達水平在激素處理下顯著上調,其中Methoprene處理后的第7天,Kr-h1上調倍數達到79.5,最終導致桔小實蠅蛹由于不能正常羽化而死亡。4桔小實蠅Met和Kr-h1基因的功能初探分別將合成好的Met、Kr-h1基因dsRNA混入染料胭脂蟲紅,對桔小實蠅4日齡幼蟲進行飼喂法RNA干擾,并通過qPCR技術檢測目的基因的沉默效果。結果表明,在iMet處理24 h后,與對照相比,Met基因表達水平顯著下調56.2%,同時Kr-h1基因表達量也受到顯著抑制,分別下調了71.1%(24 h)和42.3%(48h);在iKr-h1處理24 h和48 h后,Kr-h1基因表達水平分別顯著下調78.9%和40%。上述沉默效率表明飼喂法對桔小實蠅幼蟲RNA干擾是切實可行的。此外,RNA干擾的試蟲在化蛹時間上并沒有提前,即沒有出現(xiàn)幼蟲齡期縮短的現(xiàn)象,但相較于對照PBS,有一定的發(fā)育滯后現(xiàn)象。
【關鍵詞】：桔小實蠅 保幼激素 信號通路 定量PCR RNA干擾
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S433
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 第一章 文獻綜述13-23
• 1 桔小實蠅形態(tài)特征及幼蟲齡期劃分13
• 2 昆蟲保幼激素13-15
• 2.1 天然保幼激素及保幼激素類似物13-14
• 2.2 雙翅目昆蟲JH14-15
• 2.3 蛻皮激素和JH共同調控昆蟲蛻皮和變態(tài)發(fā)育15
• 3 JH信號通路基因15-20
• 3.1 JH受體Methoprene-tolerant (Met)15-17
• 3.2 昆蟲變態(tài)發(fā)育抑制因子Kr-h117-19
• 3.3 Broad基因19-20
• 4 JH信號通路與昆蟲其它激素信號通路的相互作用20-23
• 4.1 JH與蛻皮激素信號通路20-21
• 4.2 JH與胰島素類多肽21-23
• 引言23-25
• 第二章 桔小實蠅JH信號通路基因的克隆及序列分析25-35
• 1 材料和方法25-29
• 1.1 供試昆蟲25-26
• 1.2 主要儀器及試劑26
• 1.3 總RNA提取26-27
• 1.4 總RNA中gDNA的去除27
• 1.5 cDNA合成27-28
• 1.6 引物設計和合成28
• 1.7 PCR擴增反應28-29
• 1.8 克隆和測序29
• 1.9 生物信息學分析29
• 2 結果與分析29-33
• 2.1 桔小實蠅JH信號通路Met和Kr-h1基因的ORF克隆及保守氨基酸序列分析Methoprene-tolerent (Met)29-33
• 3 討論33-35
• 第三章 桔小實蠅JH信號通路基因的時空表達模式分析35-41
• 1 材料和方法35-37
• 1.1 供試昆蟲35
• 1.2 實驗試劑及儀器35
• 1.3 總RNA提取35-36
• 1.4 cDNA合成36
• 1.5 引物設計和合成36-37
• 1.6 實時定量PCR37
• 1.7 數據分析37
• 2 結果37-39
• 2.1 JH信號通路基因在桔小實蠅不同發(fā)育階段的表達模式37-38
• 2.2 JH信號通路基因在桔小實蠅不同組織的表達模式38-39
• 3 討論39-41
• 第四章 JH III及METHOPRENE對桔小實蠅JH信號通路基因表達的影響41-49
• 1 材料和方法41-43
• 1.1 供試昆蟲41
• 1.2 實驗試劑及儀器41
• 1.3 激素處理41-42
• 1.4 總RNA提取42
• 1.5 cDNA合成42
• 1.6 引物設計和合成42
• 1.7 實時定量PCR42-43
• 1.8 數據分析43
• 2 結果43-46
• 2.1 外源激素對桔小實蠅幼蟲的影響43-44
• 2.2 外源激素對桔小實蠅蛹的影響44-46
• 3 討論46-49
• 第五章 桔小實蠅MET和KR-H1基因功能分析49-57
• 1 材料和方法49-54
• 1.1 供試昆蟲49
• 1.2 實驗試劑及儀器49
• 1.3 dsRNA引物設計49-50
• 1.4 dsRNA合成50-53
• 1.5 dsRNA檢測53
• 1.6 dsRNA飼喂53
• 1.7 RNA干擾水平檢測和表型觀察53-54
• 2 結果54-56
• 2.1 dsRNA合成54
• 2.2 沉默效率54-55
• 2.3 表型變化55-56
• 3 討論56-57
• 第六章 主要結論和展望57-59
• 1 主要結論57
• 2 展望57-59
• 參考文獻59-67
• 在讀期間發(fā)表論文情況67-69
• 致謝69

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1 龔秀澤,白志良,林樹端;憑祥局多次從越南邊貿入境的水果中截獲桔小實蠅[J];植物檢疫;2001年02期

2 李萍;東興局多次在越南水果中截獲桔小實蠅[J];植物檢疫;2001年03期

3 張承運 ,滕丙|，

本文編號：750402