本文關(guān)鍵詞：核盤菌蛋白激發(fā)子同源物SsPemG1的功能分析

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【摘要】：核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一種廣泛分布的產(chǎn)菌核的死體營(yíng)養(yǎng)型真菌,嚴(yán)重威脅著油菜生產(chǎn)安全,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于傳統(tǒng)防治手段弊端凸顯,從基因水平研究核盤菌致病機(jī)理,尋找新一代環(huán)保、高效的微生物農(nóng)藥刻不容緩。隨著核盤菌全基因組測(cè)序完成,核盤菌DNA轉(zhuǎn)化體系以及RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)的逐漸成熟,為開(kāi)展核盤菌功能基因的研究提供便利。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的防衛(wèi)反應(yīng)以應(yīng)對(duì)病原微生物的入侵,而蛋白激發(fā)子可以刺激植物快速形成程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)阻止病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)散。因此開(kāi)展蛋白激發(fā)子的研究對(duì)于挖掘新型安全、高效的微生物農(nóng)藥意義重大。PemG1(GenBank accession number:EF062504)是一個(gè)分離自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的蛋白激發(fā)子,對(duì)誘導(dǎo)水稻抵御稻瘟病菌的侵染有較好作用。本研究使用稻瘟病菌Pem G1的氨基酸序列對(duì)核盤菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast_p,找到一個(gè)具有相同功能域和較高的序列相似度的蛋白,編碼基因SS1G_07345,將其命名為SsPemG1。故可推測(cè)Ss PemG1可能也是蛋白激發(fā)子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)擴(kuò)增核盤菌中SsPemG1編碼基因序列,構(gòu)建出SsPemG1-pSilent-1的沉默表達(dá)載體,利用PEG介導(dǎo)的核盤菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得了該基因的沉默突變菌株。通過(guò)潮霉素B抗性和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)篩選出具有良好的沉默抑制效果的突變菌株M6和M9。通過(guò)分析沉默突變菌株的表型差異和生物信息學(xué)信息,明確SsPemG1在核盤菌中的功能。表型分析結(jié)果表明:在致病性實(shí)驗(yàn)中,沉默突變體的致病性明顯較野生型強(qiáng)。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),沉默突變體比野生型和Mock菌株具有更快的生長(zhǎng)速度;對(duì)NaCl和SDS的耐受性變的更強(qiáng);形成更多對(duì)于致病性至關(guān)重要的侵染墊;細(xì)胞壁降解酶類的活性變的更強(qiáng)。SsPem G1通過(guò)調(diào)控這4個(gè)因素共同導(dǎo)致其致病力變強(qiáng)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,主要功能是結(jié)合RNA,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯,這與表型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展有助于進(jìn)一步了解核盤菌SsPemG1的功能,為研究激發(fā)子提供一個(gè)新的方法,為核盤菌的防治提供理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：核盤菌 SsPemG1 沉默 致病性 激發(fā)子
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S432.44
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-18
• 1.1 油菜菌核病和核盤菌的研究進(jìn)展10-15
• 1.1.1 油菜菌核病的危害及其防治10-12
• 1.1.2 核盤菌的研究進(jìn)展12-15
• 1.2 蛋白激發(fā)子的研究進(jìn)展15-16
• 1.3 生物信息學(xué)研究進(jìn)展16-18
• 2 引言18-19
• 3 材料與方法19-30
• 3.1 供試材料19
• 3.1.1 供試菌株19
• 3.1.2 供試植株19
• 3.1.3 化學(xué)試劑19
• 3.1.4 供試載體19
• 3.1.5 儀器設(shè)備19
• 3.1.6 常用緩沖溶液和培養(yǎng)基19
• 3.2 供試方法19-30
• 3.2.1 核盤菌NGA4菌絲總DNA和RNA的提取及cDNA的制備19-21
• 3.2.2 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及酶連、轉(zhuǎn)化21
• 3.2.3 SsPemG1基因的克隆和測(cè)序21
• 3.2.4 SsPemG1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)21-23
• 3.2.5 SsPemG1在核盤菌無(wú)性生活史各階段相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定23
• 3.2.6 沉默載體的構(gòu)建和大提質(zhì)粒23-25
• 3.2.7 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化25-26
• 3.2.8 SsPemG1沉默突變體的篩選26
• 3.2.9 SsPemG1沉默突變體的表型分析26-30
• 4 結(jié)果與分析30-45
• 4.1 SsPemG1基因的克隆和測(cè)序30-31
• 4.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果31-35
• 4.2.1 SsPemG1蛋白基本性質(zhì)31-32
• 4.2.2 SsPemG1結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)32-33
• 4.2.3 SsPemG1蛋白亞細(xì)胞定位分析33
• 4.2.4 SsPemG1互作蛋白預(yù)測(cè)33-34
• 4.2.5 多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建34-35
• 4.3 SsPemG1基因在核盤菌無(wú)性生活史各階段相對(duì)表達(dá)分析35-36
• 4.4 SsPemG1-pSilent-1 載體的構(gòu)建與驗(yàn)證36-37
• 4.5 SsPemG1沉默轉(zhuǎn)化子的篩選與驗(yàn)證37-38
• 4.6 SsPemG1沉默突變體生長(zhǎng)表型及菌核發(fā)育觀察38-39
• 4.7 SsPemG1沉默對(duì)形成侵染墊和SsGgt1基因表達(dá)的影響39-40
• 4.8 SsPemG1沉默突變體對(duì)五種脅迫因子的耐受性分析40-41
• 4.9 SsPemG1沉默突變體草酸、果膠酶、纖維素酶及蛋白酶測(cè)定41-42
• 4.10 SsPemG1沉默對(duì)核盤菌NGA4致病力的影響42-43
• 4.11 其他致病相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定43-45
• 5 小結(jié)與討論45-47
• 5.1 全文小結(jié)45
• 5.2 討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-56
• 致謝56-57
• 附錄A 化學(xué)試劑和儀器設(shè)備57-58
• 附錄B 常用緩沖溶液和培養(yǎng)基58-60
• 附錄C 部分實(shí)驗(yàn)步驟60-64
• 作者簡(jiǎn)介64

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 徐玉平;核盤菌蛋白激發(fā)子同源物SsPemG1的功能分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：731956