本文關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌NC6蛋白激發(fā)子PeBA1的分離鑒定及功能研究

  更多相關(guān)文章： 蛋白激發(fā)子 過敏反應(yīng) 活性氧爆發(fā) 誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性

【摘要】：解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是植物根際生長促進(jìn)菌中非常重要的一類生防菌。研究表明,芽孢桿菌生防機制主要包括:競爭、拮抗、誘導(dǎo)抗病性及促進(jìn)生長等4個方面。目前尚未有關(guān)于解淀粉芽孢桿菌大分子蛋白激發(fā)子的報道,本研究首次從解淀粉芽孢桿菌NC6菌株中分離純化出一種能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病反應(yīng)的新型蛋白激發(fā)子PeBA1,為進(jìn)一步闡述解淀粉芽孢桿菌誘導(dǎo)抗病性提供一定的理論基礎(chǔ)。具體實驗內(nèi)容與結(jié)果如下:1.蛋白激發(fā)子的分離純化及質(zhì)譜分析通過硫酸銨沉淀,陰離子柱交換層析,以及活性膠回收等一系列蛋白純化方法,從解淀粉芽孢桿菌NC6菌株中獲得一種能夠誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生典型過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)激發(fā)子。并對該激發(fā)子進(jìn)行質(zhì)譜分析,獲得其氨基酸序列,并命名為PeBA1(Protein elicitor from Bacillus amyloliquefaciens 1)。2.構(gòu)建PeBA1原核表達(dá)及純化系統(tǒng)克隆Pe BA1基因,并將目的基因與原核表達(dá)載體E1連接,最后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)。進(jìn)一步通過細(xì)胞超聲破碎,Ni柱親和層析,超濾除鹽濃縮獲得高濃度PeBA1重組蛋白。SDS-PAGE檢測及誘導(dǎo)煙草葉片過敏性壞死活性測試實驗驗證原核表達(dá)的準(zhǔn)確性。3.PeBA1的理化性質(zhì)及誘導(dǎo)煙草防御反應(yīng)進(jìn)一步研究PeBA1重組蛋白的理化性質(zhì)及誘導(dǎo)煙草防御反應(yīng)。PeBA1重組蛋白能夠在4、25、50、80、100℃水浴中孵育15min后保持良好的穩(wěn)定性。其所能夠引起枯斑三生煙煙草葉片過敏性壞死反應(yīng)的最低濃度為5μM。PeBA1重組蛋白能夠誘導(dǎo)煙草防御早期事件如活性氧爆發(fā)(包括過氧化氫、超氧負(fù)離子的產(chǎn)生)。同時PeBA1重組蛋白可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物,包括大量的酚類物質(zhì)形成等,其能夠增強細(xì)胞壁強度,阻止病原菌的侵染。4.PeBA1誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性通過誘導(dǎo)煙草抗病性測試,我們發(fā)現(xiàn)PeBA1重組蛋白能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對灰霉病菌和煙草花葉病毒的抗性。PeBA1重組蛋白處理的煙草葉片接種灰霉菌后,病斑直徑明顯小于蛋白緩沖液處理組,PeBA1處理的煙草葉片接種TMV后所引起病斑數(shù)和病斑大小均少于或小于緩沖液處理,證明PeBA1重組蛋白能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PeBA1重組蛋白處理煙草,能夠誘導(dǎo)水楊酸途徑相關(guān)抗病性基因如PR1a、PR1b和PR5和PAL,以及茉莉酸途徑相關(guān)部分抗病性基因如COI1和PDF1.2的轉(zhuǎn)錄上調(diào),同時也能夠引起在水楊酸介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗病性和植物根圍菌引起的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性中起重要作用的NPR1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：蛋白激發(fā)子 過敏反應(yīng) 活性氧爆發(fā) 誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S476.1
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 解淀粉芽孢桿菌12-14
• 1.1.1 解淀粉芽孢桿菌促生長活性12-13
• 1.1.2 解淀粉芽胞桿菌抗菌活性13
• 1.1.3 解淀粉芽孢桿菌誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性13-14
• 1.2 微生物源蛋白質(zhì)激發(fā)子14-15
• 1.2.1 真菌源蛋白激發(fā)子14-15
• 1.2.2 細(xì)菌源蛋白質(zhì)激發(fā)子15
• 1.3 激發(fā)子引起的植物系統(tǒng)抗病性15-18
• 1.3.1 誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性和獲得系統(tǒng)抗病性15-16
• 1.3.2 激發(fā)子誘導(dǎo)的植物抗病相關(guān)事件16-17
• 1.3.3 植物抗病性信號途徑17-18
• 1.4 研究目的及意義18-19
• 1.5 試驗方案19-20
• 第二章 解淀粉芽孢桿菌蛋白激發(fā)子的分離純化及質(zhì)譜分析20-26
• 2.1 實驗材料20
• 2.1.1 菌株與植物材料20
• 2.1.2 實驗試劑和儀器20
• 2.1.3 培養(yǎng)基與試劑配方20
• 2.2 實驗方法20-22
• 2.2.1 解淀粉芽孢桿菌NC6的發(fā)酵液培養(yǎng)20-21
• 2.2.2 蛋白激發(fā)子的分離純化21-22
• 2.3 實驗結(jié)果與分析22-24
• 2.3.1 解淀粉芽孢桿菌激發(fā)子的分離與純化22-23
• 2.3.2 解淀粉芽孢桿菌激發(fā)子的質(zhì)譜鑒定23-24
• 2.4 本章小結(jié)與討論24-26
• 第三章 蛋白激發(fā)子Pe BA1的基因克隆與原核表達(dá)26-35
• 3.1 實驗材料26-27
• 3.1.1 菌株與植物材料26
• 3.1.2 實驗試劑和儀器26
• 3.1.3 培養(yǎng)基及試劑配方26-27
• 3.2 解淀粉芽孢桿菌基因組提取27
• 3.3 Pe BA1基因克隆及載體構(gòu)建27-28
• 3.3.1 Pe BA1基因克隆27
• 3.3.2 Pe BA1基因膠回收及連接轉(zhuǎn)化27-28
• 3.4 質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)化表達(dá)28-29
• 3.5 Pe BA1的原核表達(dá)及純化29-30
• 3.5.1 Pe BA1的原核重組表達(dá)29
• 3.5.2 Pe BA1重組蛋白的純化及濃度測定29-30
• 3.6 結(jié)果與分析30-33
• 3.6.1 蛋白激發(fā)子Pe BA1基因的克隆30
• 3.6.2 Pe BA1原核表達(dá)載體的構(gòu)建30-32
• 3.6.3 Pe BA1重組蛋白的表達(dá)純化32-33
• 3.7 本章小結(jié)與討論33-35
• 第四章 Pe BA1重組蛋白激發(fā)子理化性質(zhì)及誘導(dǎo)煙草防御反應(yīng)35-44
• 4.1 實驗材料35
• 4.1.1 植物材料35
• 4.1.2 實驗試劑和儀器35
• 4.1.3 培養(yǎng)基及試劑配方35
• 4.2 實驗方法35-37
• 4.2.1 Pe BA1重組蛋白激發(fā)子理化性質(zhì)35-36
• 4.2.2 Pe BA1重組蛋白誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生早期防衛(wèi)反應(yīng)36-37
• 4.3 結(jié)果與分析37-42
• 4.3.1 Pe BA1重組蛋白引起典型的HR壞死37-38
• 4.3.2 Pe BA1重組蛋白的熱穩(wěn)定性38-39
• 4.3.3 Pe BA1重組蛋白引起過敏性壞死反應(yīng)最低濃度39-40
• 4.3.4 Pe BA1重組蛋白誘導(dǎo)活性氧積累40-41
• 4.3.5 Pe BA1重組蛋白誘導(dǎo)煙草細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)的產(chǎn)生和積累41-42
• 4.4 本章小結(jié)與討論42-44
• 第五章 Pe BA1誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性44-52
• 5.1 實驗材料44
• 5.1.1 植物及菌株材料44
• 5.1.2 實驗試劑和儀器44
• 5.1.3 培養(yǎng)基及試劑配方44
• 5.2 實驗方法44-46
• 5.2.1 Pe BA1誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對灰霉病菌的抗性44-45
• 5.2.2 Pe BA1誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對煙草花葉病毒（TMV）抗性45
• 5.2.3 熒光定量PCR檢測Pe BA1誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因表達(dá)45-46
• 5.3 實驗結(jié)果與分析46-51
• 5.3.1 Pe BA1誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對灰霉病菌的抗性46-47
• 5.3.2 Pe BA1誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對煙草花葉病毒抗性47-49
• 5.3.3 Pe BA1誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)49-51
• 5.4 本章小結(jié)與討論51-52
• 第六章 全文結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 致謝59-60
• 作者簡歷60

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