本文關(guān)鍵詞：四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物的分離純化和對(duì)植物病原真菌的抑菌活性研究

  更多相關(guān)文章： 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物 HPLC 抑菌活性 核糖體工程

【摘要】：項(xiàng)目組從浙江天目山采集的土壤中分離到一株對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)抑制作用的放線菌,鑒定為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628(Streptomyces diastatochromogenes 1628)。前期研究中發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液的正丁醇萃取物中含有多種四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物,本研究對(duì)正丁醇萃取物進(jìn)行分離純、純化,獲得3種四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物單體,并對(duì)它們的抗菌活性進(jìn)行了研究,進(jìn)一步利用核糖體工程技術(shù)(Ribosome engineering)對(duì)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628進(jìn)行了遺傳改造,提高了其產(chǎn)素水平。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628發(fā)酵液正丁醇萃取物經(jīng)過(guò)一次大孔樹脂AB-8色譜柱層析、兩次ODS色譜柱層析、TLC分析和HPLC檢測(cè)。最終得到三種四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物單體,編號(hào)為ODS5-8、ODS5-7-2、ODS-5-7-4。通過(guò)質(zhì)譜、核磁共振分析,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道其中ODS5-8被鑒定為四霉素A(Tetramycin A),ODS5-7-2被鑒定為新的四霉素類抗生素,命名為四霉素P(Tetramycin P),ODS5-7-4被鑒定為四烯菌素B(Tetrin B)。建立了四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物高效液相色譜檢測(cè)方法,分析方法為:采用Waters Sun Fire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流動(dòng)相A為甲醇,B為水,梯度洗脫,流速:1 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):304 nm,進(jìn)樣量:5μl,柱溫:30℃。繪制Tetramycin A、Tetramycin P、Tetrin B HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線,在25~500 mg/L濃度線性范圍內(nèi),R2依次為0.9914、0.9862、0.9963,線性關(guān)系良好,平均加樣回收率依次為100.83%、100.15%、100.51%,RSD(%)分別為4.57、4.12、7.89,方法準(zhǔn)確可靠。本測(cè)定方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng),可用于發(fā)酵液中三種四烯化合物在HPLC方法中的定性定量分析。利用菌絲生長(zhǎng)速率法研究了Tetramycin A、Tetramycin P對(duì)水稻紋枯病菌(Rhizoctorzia solani)、黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)5種常見植物病原真菌的抑菌活性。結(jié)果表明Tetramycin A、Tetramycin P對(duì)5種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果較好。Tetramycin A抑制5種病原菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值分別為3.93、2.13、3.27、5.36、5.99 mg/L,隨著濃度的上升對(duì)5種植物病原真菌抑制效果增加,濃度為25 mg/L時(shí)平均抑制率為97.7%。Tetramycin P抑制5種病原菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值分別為3.83、3.29、3.31、4.96、5.65 mg/L,隨著濃度的上升對(duì)5種植物病原真菌抑制效果增加,濃度為30 mg/L時(shí)平均抑制率為97.3%。利用孢子萌發(fā)率測(cè)定法測(cè)定Tetramycin A、Tetramycin P對(duì)黃瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)率的影響,結(jié)果表明對(duì)兩種病原菌孢子萌發(fā)抑制效果較好。Tetramycin A在濃度為125 mg/L時(shí),對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)抑制效果較好,孢子萌發(fā)率為0%,黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)率為4%,效果稍弱但仍顯著低于對(duì)照。Tetramycin P在濃度為75mg/L時(shí),對(duì)番茄灰霉病菌孢子抑制效果較好萌發(fā)率為0%,黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)率為5%,效果稍弱但仍顯著低于對(duì)照。實(shí)驗(yàn)表明Tetramycin A、Tetramycin P對(duì)常見的5種植物病原菌均有較好的抑菌活性。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628可以合成四種不同的抗生素包括豐加霉素、Tetramycin A、Tetramycin P和Tetrin B。利用核糖體工程技術(shù)由鏈霉素、利福平、巴龍霉素、紅霉素、慶大霉素和四環(huán)素6種抗生素誘導(dǎo)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628突變,得到抗性突變株SD10、SD88、SD99、SD143、SD160、SD189和SD218,其中SD10、SD143為低濃度鏈霉素和高濃度鏈霉素誘導(dǎo)突變得到。7株突變株中,由紅霉素誘導(dǎo)得到的突變株SD160產(chǎn)生的豐加霉素和Tetramycin A的濃度達(dá)到678 mg/L和1005 mg/L,分別為野生型1628產(chǎn)量的3.8和5.4倍;由巴龍霉素誘導(dǎo)得到的突變株SD99產(chǎn)生的Tetramycin P和Tetrin B的濃度達(dá)到1015 mg/L和583 mg/L,分別為野生型1628產(chǎn)量的3.8和5.1倍。結(jié)果表明核糖體工程技術(shù)可以有效的提高淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628中四種抗生素的產(chǎn)量,均較原始菌株提高了3~5倍不等,為四種抗生素實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物 HPLC 抑菌活性 核糖體工程
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TQ927;S432.44
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-16
• 1 前言16-24
• 1.1 農(nóng)用抗生素16-18
• 1.1.1 農(nóng)用抗生素的研究背景16
• 1.1.2 農(nóng)用抗生素使用的研究進(jìn)展16-18
• 1.1.3 農(nóng)用抗生素使用面臨問(wèn)題18
• 1.2 多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物18-20
• 1.2.1 多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物概述19
• 1.2.2 多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物功能特點(diǎn)19-20
• 1.3 核糖體工程技術(shù)20-23
• 1.3.1 核糖體工程技術(shù)的研究背景20-21
• 1.3.2 核糖體工程技術(shù)的研究?jī)?nèi)容21-22
• 1.3.3 核糖體工程技術(shù)的研究進(jìn)展22-23
• 1.4 本課題研究的內(nèi)容及意義23-24
• 2 四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物的分離純化24-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25
• 2.1.1 菌種25
• 2.1.2 主要試劑25
• 2.1.3 培養(yǎng)基25
• 2.1.4 主要儀器25
• 2.2 試驗(yàn)方法25-27
• 2.2.1 1628 液體發(fā)酵25-26
• 2.2.2 正丁醇萃取物的制備26
• 2.2.3 正丁醇浸膏的大孔樹脂AB-8 柱層析26
• 2.2.4 大孔樹脂AB-8 分離得到餾分的ODS分離純化26-27
• 2.2.5 抗生素單體的結(jié)構(gòu)鑒定27
• 2.3 結(jié)果與分析27-36
• 2.3.1 大孔樹脂AB-8 柱層析結(jié)果27-29
• 2.3.2 ODS柱層析結(jié)果29-32
• 2.3.3 餾分ODS5-8、ODS572、ODS57-4 的結(jié)構(gòu)鑒定32-36
• 2.4 討論36-38
• 3 四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物HPLC檢測(cè)方法的建立38-43
• 3.1 儀器與試藥38
• 3.2 方法與結(jié)果38-41
• 3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備38
• 3.2.2 樣品溶液制備38-39
• 3.2.3 色譜條件39
• 3.2.4 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制39-40
• 3.2.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)40-41
• 3.2.6 回收率實(shí)驗(yàn)41
• 3.2.7 樣品測(cè)定41
• 3.3 討論41-43
• 3.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇41
• 3.3.2 流動(dòng)相的選擇41-42
• 3.3.3 檢測(cè)方法評(píng)價(jià)42-43
• 4 四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物對(duì)植物病原真菌抑菌活性研究43-50
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 4.2 試驗(yàn)內(nèi)容43-44
• 4.2.1 Tetramycin A、Tetramycin P對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)率的影響43-44
• 4.2.2 Tetramycin A、Tetramycin P對(duì)植物病原真菌孢子萌發(fā)率的影響44
• 4.3 數(shù)據(jù)與分析44-49
• 4.3.1 Tetramycin A、Tetramycin P對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)率的影響44-47
• 4.3.2 Tetramycin A、Tetramycin P對(duì)植物病原真菌孢子萌發(fā)率的影響47-49
• 4.4 討論49-50
• 5 利用核糖體工程技術(shù)提高1628次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量50-55
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 5.1.1 菌株及抗生素50
• 5.1.2 培養(yǎng)基50-51
• 5.1.3 HPLC分析方法51
• 5.2 試驗(yàn)方法51-52
• 5.3 結(jié)果52-53
• 5.4 討論53-55
• 6 總結(jié)與展望55-58
• 6.1 總結(jié)55-56
• 6.2 展望56-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 作者簡(jiǎn)歷63

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