增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)起初在患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中發(fā)現(xiàn),之后在其他物種(如哺乳動物,果蠅等)中也發(fā)現(xiàn)了它的存在。由于PCNA蛋白結(jié)構(gòu)在進化上的保守性,使得病毒和原核細胞中也具有類似PCNA的DNA聚合酶輔助因子。在不同進化水平的生物中,它們具有相同的二級結(jié)構(gòu)單位—?螺旋和?折疊,和相似的三級結(jié)構(gòu)(一個可以在DNA鏈上滑動的環(huán)形滑動夾)。哺乳動物的PCNA以同源三聚體的形式存在于細胞核,是DNA合成不可或缺的因子,它的表達水平與細胞周期的變化同步。在桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)中鑒定有與編碼增殖細胞核抗原蛋白序列同源的基因pcna,又稱AcOrf-49,全長771 bp,但是在DNA復制中的作用還不明確。在桿狀病毒的長期進化過程中,其基因組中的某些基因會發(fā)生高頻率的缺失和獲得。其中,AcMNPV的pcna基因(Ac-pcna)就是由其宿主Sf9(Spodoptera fr...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 桿狀病毒
        1.1.1 桿狀病毒概述
        1.1.2 桿狀病毒分類地位
        1.1.3 桿狀病毒發(fā)育循環(huán)
        1.1.4 桿狀病毒病毒粒子相關(guān)蛋白分類
        1.1.5 昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)
    1.2 桿狀病毒基因組DNA復制和基因表達調(diào)控相關(guān)基因
        1.2.1 桿狀病毒DNA復制原點hr
        1.2.2 桿狀病毒基因表達調(diào)控的級聯(lián)模型
        1.2.3 早期表達調(diào)節(jié)基因:ie2
    1.3 增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)
        1.3.1 增殖細胞核抗原的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)特征
        1.3.2 增殖細胞核抗原的生物學功能
        1.3.3 AcMNPV和Sf9細胞的增殖細胞核抗原
    1.4 反式轉(zhuǎn)錄因子P53
        1.4.1 病毒感染與宿主細胞凋亡
        1.4.2 宿主細胞凋亡與P53蛋白
    1.5 病毒感染與葡萄糖代謝
        1.5.1 病毒感染對細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)
        1.5.2 病毒感染對細胞葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)
    1.6 昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)的新進展
    1.7 論文的設(shè)計思路
        1.7.1 研究內(nèi)容與意義
        1.7.2 研究方法
        1.7.3 實驗流程
        1.7.4 研究創(chuàng)新點
第二章 重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的構(gòu)建與核蛋白Ac/Sf-PCNA-EGFP的表達分析
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 主要實驗儀器
        2.2.2 主要試劑及其配置
        2.2.3 細胞、病毒、菌株及載體
    2.3 實驗方法
        2.3.1 Ac/Sf-pcna的序列分析和其蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模
        2.3.2 昆蟲Sf9細胞的培養(yǎng)
        2.3.3 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的構(gòu)建
        2.3.4 蝕斑法測定重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的滴度
        2.3.5 熒光顯微鏡觀察和Westernblot檢測Ac/Sf-PCNA-EGFP在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9宿主細胞中的表達量
        2.3.6 Western blot檢測在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9宿主細胞中Ac/Sf-pcna-EGFP在核內(nèi)的聚集情況
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 Ac/Sf-pcna的序列分析及其蛋白三維結(jié)構(gòu)模型
        2.4.2 重組病毒AcMNPV-Ac-pcna-EGFP的構(gòu)建
        2.4.3 重組病毒AcMNPV-Sf-pcna-EGFP的構(gòu)建
        2.4.4 AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中Ac/Sf-PCNA-EGFP的表達量分析
        2.4.5 AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中Ac/Sf-PCNA-EGFP在核內(nèi)聚集的分析
    2.5 討論
第三章 增殖細胞核抗原Ac/Sf-pcna的功能分析
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 主要實驗儀器
        3.2.2 主要試劑及其配制
        3.2.3 細胞、病毒、菌株、載體和蟲卵
    3.3 實驗方法
        3.3.1 絕對定量PCR檢測用標準質(zhì)粒pUCm-T-hr3、pUCm-T-hsp90的構(gòu)建
        3.3.2 Sf9細胞的培養(yǎng)
        3.3.3 絕對定量PCR檢測在細胞內(nèi)及外分泌的重組病毒的基因組DNA的復制水平
        3.3.4 絕對定量PCR檢測重組病毒對Sf9基因組DNA復制的影響
        3.3.5 蝕斑實驗檢測重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對子代病毒增殖的影響
        3.3.6 Real-time PCR 檢測重組桿狀病毒Ac MNPV-Ac-pcna-EGFP對Ac MNPV晚期基因 38K、vp39轉(zhuǎn)錄水平的影響
        3.3.7 Real-time PCR檢測重組桿狀病毒Ac MNPV-Ac-pcna-EGFP對Ac MNPV極早期基因ie2轉(zhuǎn)錄水平的影響
        3.3.8 蟲試實驗檢測重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的抗蟲活性
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 絕對定量PCR檢測用標準質(zhì)粒pUCm-T-hr3和pUCm-T-hsp90的構(gòu)建
        3.4.2 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對病毒基因組DNA復制的影響分析
        3.4.3 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對Sf9基因組DNA復制的影響分析
        3.4.4 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對子代病毒增殖的影響分析
        3.4.5 增殖細胞核抗原Ac-pcna對AcMNPV晚期基因38K、vp39以及極早期基因ie2轉(zhuǎn)錄水平的影響分析
        3.4.6 重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的抗蟲效率分析
    3.5 討論
第四章 重組桿狀病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP對宿主Sf9細胞凋亡蛋白SfP53表達、葡萄糖代謝及外源蛋白表達的影響
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 主要實驗儀器
        4.2.2 主要試劑及其配置
        4.2.3 細胞、病毒
    4.3 實驗方法
        4.3.1 Sf9細胞的培養(yǎng)
        4.3.2 Western blot分析重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中SfP53的表達
        4.3.3 Western blot分析重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中核內(nèi)SfP53的積累
        4.3.4 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中葡萄糖含量的分析
        4.3.5 Western blot分析不同感染復數(shù)的AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中外源蛋白Renilla Luciferase的表達
        4.3.6 Western blot分析在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染Sf9細胞的過程中外源蛋白Renilla Luciferase的表達
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中SfP53的表達量分析
        4.4.2 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中核內(nèi)SfP53的積累分析
        4.4.3 重組病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中葡萄糖含量的分析
        4.4.4 不同感染復數(shù)的AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9細胞中外源蛋白Renilla Luciferase的表達量分析
        4.4.5 在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染Sf9細胞的過程中外源蛋白Renilla Luciferase的表達量分析
    4.5 討論
總結(jié)與展望
參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文
致謝
個人簡況及聯(lián)系方式



本文編號：3807744