西洋參根腐病作為土傳病害,給西洋參的種植造成了嚴重影響。而木霉作為一種重要的生防真菌,在生物防治領域有重要的貢獻。實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn),深綠木霉（Trichoderma atroviride）HB20111對該病具有較好的防治效果。因此,本論文以深綠木霉為研究對象,一方面利用分子標簽技術,改造深綠木霉菌株,使其成為我們“可視化”的工具。另一方面,通過高通量測序,從土壤微生物群落的角度,探究應用深綠木霉后對西洋參根際土壤微生物群落的影響,從生態(tài)學角度探究深綠木霉HB20111防治根腐病的相關機制,以期為西洋參根腐病相關的生物防治提供一定的理論依據(jù)。實驗取得的結果如下:（1）以植物與農(nóng)桿菌雙元表達質(zhì)粒（p CAMBIA1301）為母載體,在多克隆為點處引入來源于真菌RNAi基因沉默干擾質(zhì)粒（p Silent-1）的Hyg表達框、Trcp啟動子和終止子序列。構建了絲狀真菌表達載體P-Trcp-HYG-Ds Red-GPDA,然后以含紅色熒光蛋白基因的質(zhì)粒p CMV-C-Ds Red為模板,克隆獲得紅色熒光蛋白基因序列,插入載體多克隆位點作為報告基因;同時在紅色熒光蛋白N端引入真菌gpd A啟... 

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 木霉菌在生防方面的研究進展
        1.1.1 木霉菌拮抗機制
        1.1.2 木霉菌促生作用
        1.1.3 木霉菌對作物的生防研究進展
    1.2 農(nóng)桿菌介導的絲狀真菌熒光蛋白遺傳轉化研究
        1.2.1 農(nóng)桿菌介導轉化
        1.2.2 農(nóng)桿菌介導(ATMT)的真菌轉化的特點
        1.2.3 熒光蛋白標記在植物病理中的應用
    1.3 西洋參根腐病相關研究進展
        1.3.1 西洋參根腐病
        1.3.2 生物防治相關研究
    1.4 土壤微生物群落的研究進展
        1.4.1 研究土壤微生物的重要性
        1.4.2 高通量測序技術探究土壤微生物
    1.5 本實驗的研究意義和技術路線
        1.5.1 研究意義
        1.5.2 技術路線
第2章 真菌熒光蛋白表達載體的構建
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 試劑
        2.1.3 所用引物及序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 質(zhì)粒的轉化
        2.2.2 質(zhì)粒的提取
        2.2.3 實驗操作
        2.2.4 載體構建步驟
        2.2.5 構建載體轉化與驗證
    2.3 結果與討論
        2.3.1 重組質(zhì)粒圖譜
        2.3.2 PCR檢測電泳結果
        2.3.3 酶切檢測電泳結果
        2.3.4 測序結果
    2.4 本章小結
第3章 農(nóng)桿菌介導深綠木霉轉化體系的構建與優(yōu)化
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株及質(zhì)粒
        3.1.2 培養(yǎng)基
        3.1.3 試劑及器材
    3.2 實驗方法
        3.2.1 農(nóng)桿菌的轉化
        3.2.2 確定抑制農(nóng)桿菌生長所需的頭孢霉素濃度
        3.2.3 確定篩選木霉轉化子所需的潮霉素B濃度
        3.2.4 農(nóng)桿菌介導轉化深綠木霉
        3.2.5 木霉基因組的提取與純化
        3.2.6 木霉轉化子的驗證
        3.2.7 假定轉化子的遺傳穩(wěn)定性分析
        3.2.8 深綠木霉轉化條件的優(yōu)化
    3.3 實驗結果
        3.3.1 農(nóng)桿菌轉化PCR驗證
        3.3.2 篩選轉化子所需潮霉素的B濃度
        3.3.3 抑制農(nóng)桿菌生長所需的頭孢霉素濃度
        3.3.4 假轉化子檢測
        3.3.5 轉化子的遺傳穩(wěn)定性分析
        3.3.6 轉化條件的優(yōu)化
        3.3.7 不同農(nóng)桿菌對ATMT介導轉化深綠木霉的轉化效率的影響
    3.4 討論
    3.5 本章小結
第4章 高通量測序分析深綠木霉對西洋參根腐病的生防作用
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 試劑與耗材
    4.2 實驗方法
        4.2.1 實驗設計
        4.2.2 現(xiàn)場準備
        4.2.3 樣品的收集
        4.2.4 樣品的處理與調(diào)查
        4.2.5 土壤樣品基因組的提取
        4.2.6 測序分析
    4.3 結果與討論
        4.3.1 接種深綠木霉對西洋參出苗率的影響
        4.3.2 接種深綠木霉對西洋參發(fā)病率的影響
        4.3.3 OUT聚類分析
        4.3.4 Alpha多樣性分析
        4.3.5 Bate多樣性分析
        4.3.6 菌群差異分析
        4.3.7 土壤微生物的功能預測與分析
        4.3.8 微生物之間的互作關系分析
    4.4 本章小結
第5章 全文總結
    5.1 總結
    5.2 有待進一步研究的問題
參考文獻
致謝
在學期間主要科研成果
    一、發(fā)表學術論文
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]木霉菌促生與拮抗作用研究進展[J]. 胡瓊,劉茂泉.  農(nóng)藥. 2019(07)
[2]棘孢木霉活性代謝產(chǎn)物的初步分離及其抑菌與促生長功能[J]. 劉暢,吳長景,竇愷,劉志華,何正權,張福麗,龐麗,宋昊躍,葛紅蓮.  天津農(nóng)業(yè)科學. 2019(07)
[3]哈茨木霉T2-16的GFP標記及其生防特性[J]. 田程,張屹,肖姬玲,朱菲瑩,唐炎英,魏林,梁志懷.  中國生物防治學報. 2019(02)
[4]基于高通量測序的西洋參根際土壤細菌群落分析[J]. 李麗,蔣景龍.  中藥材. 2019(01)
[5]西洋參根腐病發(fā)生與根際土壤細菌群落結構變化關系研究[J]. 蔣景龍,余妙,李麗,焦成瑾,徐皓,任緒明,楊玲娟.  中草藥. 2018(18)
[6]木霉融合子Tpf-2的定殖及其對番茄防御酶系的影響[J]. 李紀順,陳凱,李玲,趙忠娟,楊玉忠,楊合同.  植物保護. 2018(04)
[7]壓砂西瓜枯萎病生防木霉菌篩選及其拮抗機制研究[J]. 張麗榮,李鵬,康萍芝,杜玉寧,陳杭.  河南農(nóng)業(yè)科學. 2018(05)
[8]不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用[J]. 谷祖敏,畢卉,張兵,田曉穎.  西北農(nóng)業(yè)學報. 2018(03)
[9]木霉菌在農(nóng)業(yè)中的應用研究進展[J]. 袁揚,王胤晨,韓玉竹,張錦華,曾兵.  江蘇農(nóng)業(yè)科學. 2018(03)
[10]西洋參根腐病發(fā)生與根際真菌群落變化關系研究[J]. 余妙,蔣景龍,任緒明,李麗,焦成瑾,楊玲娟,徐皓.  中國中藥雜志. 2018(10)

博士論文
[1]農(nóng)桿菌介導哈茨木霉轉化系統(tǒng)優(yōu)化及突變體分析[D]. 黃亞麗.中國農(nóng)業(yè)科學院 2008
[2]哈茨木霉（Trichoderma harzianum）發(fā)酵液中對豇豆具促生活性物質(zhì)的研究[D]. 魏林.湖南農(nóng)業(yè)大學 2005

碩士論文
[1]小麥根腐病菌的熒光標記及其與小麥的互作研究[D]. 閆立敏.河北科技師范學院 2012
[2]綠色木霉代謝抗生物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化、特性及其對芒果炭疽菌抑制作用研究[D]. 蔣雨.四川農(nóng)業(yè)大學 2011



本文編號：3679027