苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Ac MNPV）是桿狀病毒的模式種,晚期表達(dá)因子LEF-10對病毒的復(fù)制是必需的,但其功能及調(diào)控機制尚不清楚。先前研究表明,LEF-1 0 蛋白具有朊病毒特性,是一個由桿狀病毒編碼的朊病毒。當(dāng)LEF-10第21位的氨基酸殘基由亮氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢?顯著影響其朊病毒狀態(tài)并上調(diào)病毒晚期基因的表達(dá)。先前的酵母雙雜交實驗證實LEF-10與LEF-6、LEF-12和P47之間存在相互作用。本研究共分為兩部分,第一部分采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測一系列LEF-1 0 突變體對LEF-1 0功能及其朊病毒狀態(tài)的影響;第二部分通過AC-Seq、Pulldown和Bi FC技術(shù),對LEF-10的功能進行探究。第一部分,本研究首先構(gòu)建了異位回補突變體LEF-10的重組桿狀病毒lef-10^L21XBacmid,其中LEF-10的第21位氨基酸殘基飽和突變?yōu)槠渌?9種氨基酸殘基。重組病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后,只有野生型、L21I、L21V、L21F、L21C、L21M、L21A七種重組病毒能產(chǎn)生有感染性的子代病毒粒子。同時,本研究構(gòu)建了原位突變LEF-10... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

所示，盡管兩種病毒粒子的結(jié)構(gòu)相似并且都有類似的桿狀核衣殼，但其囊膜的來源及囊膜蛋白的組成不同

4℃保存。2.2.2.2重組病毒lef-10L21XBacmid的感染（1）將Sf9細(xì)胞均勻鋪入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度約為70％；（2）將20μLlef-10L21XBacmid重組病毒逐滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，28℃靜置培養(yǎng)5-7天；（3）使用倒置熒光顯微鏡對感染結(jié)果進行拍照，收集病毒上清即病毒P1代，于4℃保存。2.3結(jié)果與分析2.3.1pTriEx-LEF-10L21X-DsRed質(zhì)粒的構(gòu)建以pTriEx-LEF-10L21X-DsRed質(zhì)粒為模板，利用引物擴增可得到大小為226bp的目的片段。實際PCR擴增lef-10L21X片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖2-1A）。對測序正確的重組質(zhì)粒pTriEx-LEF-10L21X-DsRed進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，質(zhì)粒大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖2-1B)。圖2-1構(gòu)建pTriEx-LEF-10L21X-DsRed質(zhì)粒檢測（A）lef-10L21X片段PCR結(jié)果；（B）pTriEx-LEF-10L21X-DsRed質(zhì)粒檢測Fig.2-1ConstructionofpTriEx-LEF-10L21X-DsRedplasmid(A)Detectionoflef-10L21XfragmentPCR;(B)DetectionofpTriEx-LEF-10L21X-DsRedplasmids注：后文凝膠圖樣品以下文順序為基準(zhǔn)。Note:Thefollowinggelsamplesarebasedonthefollowingsequence.（A）M：DNAMarker;1~19：lef-10L21G、lef-10L21I、lef-10L21P、lef-10L21V、lef-10L21F、lef-10L21W、lef-10L21Y、lef-10L21D、lef-10L21E、lef-10L21R、lef-10L21H、lef-10L21K、lef-10L21S、lef-10L21T、lef-10L21C、lef-10L21M、lef-10L21N、lef-10L21Q、lef-10L21A;（B）M：DNAMarker;1~20:pTriEx-LEF-10L21G-DsRed、pTriEx-LEF-10L21I-DsRed、pTriEx-LEF-10L21P-DsRed、pTriEx-LEF-10L21V-DsRed、pTriEx-LEF-10L21F-DsRed、

西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文20圖中右下角顯示標(biāo)尺，標(biāo)尺大小：200μmFigure2-2Fluorescencemicroscopicobservationoftransfectionof20ectopicinsertionofrecombinantvirusesTherulerisshowninthelowerrightcornerofthepicture,therulersize:200μm2.3.3熒光顯微鏡法分析lef-10L21XBacmid的感染情況將20種重組病毒的P0代病毒感染Sf9細(xì)胞，感染5天后，經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察。如圖2-3顯示，只有l(wèi)ef-10WTBacmid、lef-10L21IBacmid、lef-10L21ABacmid、lef-10L21FBacmid、lef-10L21CBacmid、lef-10L21MBacmid、lef-10L21VBacmid的7種異位回補重組病毒能產(chǎn)生紅色熒光蛋白的熒光信號，其他13種異位回補重組病毒均無熒光信號。這表明只有LEF-10L21I、LEF-10L21V、LEF-10L21F、LEF-10L21C、LEF-10L21M、LEF-10L21A六種突變型LEF-10蛋白能功能性回補LEF-10蛋白。圖2-3異位回補重組病毒的感染的熒光顯微鏡觀察圖中右下角顯示標(biāo)尺，標(biāo)尺大�。�200μmFigure2-3FluorescencemicroscopicobservationofectopicinsertionofrecombinantvirusinfectionsTherulerisshowninthelowerrightcornerofthepicture,therulersize:200μm

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]測定桿狀病毒滴度方法的研究進展[J]. 黃仕和,余模松.  微生物學(xué)免疫學(xué)進展. 2007(02)



本文編號：3569804