蟲生真菌是一種環(huán)境友好型真菌，在防治農林害蟲時有對環(huán)境無污染、無殘留和不易產生抗藥性等優(yōu)點。隨著人們環(huán)保意識的增強，人們對環(huán)境友好型農藥的研究也在逐漸加強。萊氏野村菌是一種重要的昆蟲病原真菌，在田間能夠侵染多種夜蛾科害蟲并引起流行病。萊氏野村菌的有效成分為分生孢子，但是由于其產孢需要苛刻的營養(yǎng)和持續(xù)光照，限制了大規(guī)模生產。重慶大學生命科學學院微生物實驗室采用誘導發(fā)酵技術培養(yǎng)出了微菌核，并對其的抗逆性和毒力等進行研究，證實微菌核可以代替分生孢子作為有效的活性成分。其后，采用比較轉錄組技術研究微菌核形成的分子機理，發(fā)現(xiàn)在微菌核形成過程中伴隨著菌絲的極性生長和氧脅迫（ROS）的產生。本論文是從比較轉錄組上調表達的cDNA文庫中挑取racA與cdc42基因，將其克隆并證明二者參與菌絲的極性生長和微菌核的形成。主要研究成果：①目標基因克隆鑒定：采用SMART RACE RT-PCR技術獲得racA與cdc42的cDNA和基因組序列，ORF分別為657bp和555bp，各自編碼218和184個氨基酸；②目標基因的生物信息學分析：采用生物信息學軟件對蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)，RacA與Cdc42蛋白都有... 

【文章來源】：重慶大學重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
1 緒論
    1.1 引言
    1.2 立題依據(jù)
        1.2.1 萊氏野村菌的研究進展
        1.2.2 微菌核的研究進展
        1.2.3 RacA 與 Cdc42 蛋白的研究進展
        1.2.4 RacA、Cdc42 與 NADPH 復合體以及 ROS 之間關系的研究
    1.3 研究目的
    1.4 研究內容和技術路線
        1.4.1 研究內容
        1.4.2 技術路線
    1.5 本研究創(chuàng)新之處
2 racA 和 cdc42 全長 cDNA 與基因組的克隆與分析
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗用菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要設備儀器
        2.1.4 主要溶液和培養(yǎng)基的配制
    2.2 主要試驗方法
        2.2.1 萊氏野村菌微菌核的培養(yǎng)
        2.2.2 萊氏野村菌微菌核總 RNA 的提取
        2.2.3 萊氏野村菌 RACE 技術的 cDNA 一鏈的獲得
        2.2.4 萊氏野村菌 RACE 技術的獲得 cDNA 的全長
        2.2.5 PCR 產物的測序
        2.2.6 全長 cDNA 的測通及基因組的克隆
        2.2.7 racA 和 cdc42 的生物信息學及進化分析
    2.3 結果與分析
        2.3.1 racA 與 cdc42 的 3'/5'RACE 的擴增
        2.3.2 racA 與 cdc42 的基因組克隆和序列分析
        2.3.3 RacA 與 Cdc42 蛋白生物信息學及進化關系分析
3 racA、cdc42、noxA 和 noxR 的表達模式分析
    3.1 試驗材料
        3.1.1 試驗菌株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要設備及儀器
        3.1.4 主要培養(yǎng)基
    3.2 試驗方法
        3.2.1 微菌核形成的時期及材料收集
        3.2.2 微菌核形成各個時期菌體 RNA 的提取及 cDNA 一鏈的合成
        3.2.3 qPCR 引物設計
        3.2.4 萊氏野村菌 racA、cdc42、noxA 和 noxR 的表達模式分析
        3.2.5 qPCR 結果分析
    3.3 試驗結果與分析
        3.3.1 微菌核形成的各個時期
        3.3.2 racA 與 cdc42 的表達模式
        3.3.3 noxA 與 noxR 的表達模式
4 RNAi 的方法研究 racA 與 cdc42 的功能
    4.1 試驗材料
        4.1.1 試驗菌株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要設備儀器
        4.1.4 主要培養(yǎng)基和溶液
    4.2 主要試驗方法
        4.2.1 萊氏野村菌 racA 與 cdc42 干擾引物的設計
        4.2.2 萊氏野村菌 racA 與 cdc42 干擾片段擴增
        4.2.3 dsRNA 的體外合成
        4.2.4 dsRNA 的純化
        4.2.5 dsRNA 的酶切消化
        4.2.6 siRNA 的純化
        4.2.7 siRNA 的轉化（改良的 PEG/Licl 的方法）
        4.2.8 最適 siRNA 濃度的確定以及干擾效率的測定
        4.2.9 菌落形態(tài)、菌絲兩態(tài)型轉變、孢子形態(tài)以及產孢量的測定
        4.2.10 菌絲及微菌核形態(tài)、微菌核數(shù)量的測定
        4.2.11 Reactive Oxygen Species (ROS)的檢測
        4.2.12 干擾后 NOX 復合體的表達模式
        4.2.13 毒力生測
        4.2.14 數(shù)據(jù)處理
    4.3 試驗結果與分析
        4.3.1 最適 siRNA 濃度的確定以及干擾效率的測定
        4.3.2 菌落形態(tài)、菌絲兩態(tài)型轉變、孢子形態(tài)以及產孢量的測定
        4.3.3 菌絲及微菌核形態(tài)、微菌核數(shù)量的測定
        4.3.4 ROS 的檢測以及干擾后 NOX 復合體的表達模式
        4.3.5 毒力生測
5 racA、cdc42、noxA、noxR 和 cdc24 之間關系初探
    5.1 試驗材料
    5.2 試驗方法
    5.3 試驗結果與分析
6 討論
7 主要結論及后續(xù)工作
    7.1 主要研究結論
    7.2 后續(xù)試驗建議
致謝
參考文獻
附錄 作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表論文的目錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]萊氏野村菌CQNr01微菌核的人工誘導培養(yǎng)[J]. 殷幼平,黃姍,宋章永,王中康.  中國農業(yè)科學. 2012(23)
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[3]蟲生真菌分子致病機理及基因工程改造研究進展[J]. 呂丁丁,李增智,王成樹.  微生物學通報. 2008(03)
[4]中國蟲生真菌應用50年簡史（英文）[J]. 李增智.  安徽農業(yè)大學學報. 2007(02)
[5]蟲生真菌對害蟲防治的研究與應用[J]. 何恒果,李正躍,陳斌,文良柱.  云南農業(yè)大學學報. 2004(02)



本文編號：3433329