葡萄根瘤蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）基因的克
發(fā)布時間：2021-08-14 17:00
葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae（Fitch）（半翅目:根瘤蚜科）是一種世界性分布的單食性害蟲,只危害葡萄屬植物,也是我國重要的植物檢疫性有害生物之一,可對葡萄造成毀滅性危害。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是好氧生物中一類重要的多功能酶,主要參與內(nèi)源性和外源性化合物的解毒,還參與細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、激素生物合成和抗氧化應(yīng)激保護。深入研究葡萄根瘤蚜體內(nèi)GSTs基因的功能對于干擾其解毒過程的害蟲治理手段具有深遠意義。本文以葡萄根瘤蚜為研究對象,對其谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶進行基因克隆獲得了7個胞質(zhì)型Dvi GSTs,并在此基礎(chǔ)上進行了原核表達、蛋白純化、重組蛋白的酶動力學參數(shù)測定、抗氧化能力檢測以及農(nóng)藥對重組蛋白的離體抑制測定,主要研究結(jié)果如下:1、基因克隆:克隆獲得了7個胞質(zhì)型Dvi GSTs,分別為Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTt1、Dvi GSTo1、Dvi GSTs1、Dvi GSTs2和Dvi GSTs3,分屬于四個不同的家族,即Delta、Theta、Omega和Sigma,經(jīng)測序驗證各基因的序列與NCBI中序列一致。7個GSTs基因開放閱...
【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：72 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
昆蟲GSTs與人類PiGST的比較（Kettermanetal.2011）
西北農(nóng)林科技大學碩士學位論文81.3.3谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的功能概述GSTs是絕大多數(shù)生物體中發(fā)現(xiàn)的第二階段解毒酶的一個主要家族，其抗藥性的主要機制如圖1-2所示。第一種情況是GSTs催化底物GSH與殺蟲劑進行結(jié)合，產(chǎn)生毒性較小的可溶性結(jié)合物（圖1-2a）。第二種情況是GSTs參與DDT的解毒過程，主要形式為以GSH作為協(xié)同因子，共同催化DDT，將其直接代謝為無毒的DDE（圖1-2b）。在圖1-2c中是第三種情況，昆蟲攝入殺蟲劑后會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，GSTs可顯示過氧化物酶活性，從而減少該反應(yīng)過程中產(chǎn)生有毒的過氧化物。同時GSTs也可通過殺蟲劑的非催化被動結(jié)合產(chǎn)生抗性（圖1-2d）。在昆蟲的整個解毒過程中GSTs參與的代謝抗性分為兩種情況：直接代謝和間接代謝，其中間接代謝是指代謝由其他解毒酶（如P450s和CCEs）產(chǎn)生的次級產(chǎn)物。該酶最著名的是谷胱甘肽（GSH）偶聯(lián)反應(yīng)，它們能催化親電的內(nèi)源和外源化合物與谷胱甘肽（GSH）的巰基結(jié)合，這中和了化學物質(zhì)的高活性親核位點，增加了產(chǎn)物的水溶性，從而促進了它從細胞中的排泄（Pavlidietal.2018）。由于GSH存在于高濃度的細胞內(nèi)，GSTs的GSH結(jié)合位點可能總是被占據(jù)，但N-末端結(jié)構(gòu)域中的“活性位點殘基”能與谷胱甘肽的巰基相互作用并激活巰基，因此GSTs對GSH有很高的親和力。在大多數(shù)哺乳動物GSTs中，活性位點殘基是酪氨酸，但在Delta和Epsilon昆蟲GSTs中，這種作用是由絲氨酸殘基執(zhí)行的（Enayatietal.2005）。圖1-2GSTs介導的抗藥性的主要機制（Pavlidietal.2018）Fig1-2ThemainmechanismofGSTs-mediatedresistance（Pavlidietal.2018）
西北農(nóng)林科技大學碩士學位論文28bpMWbpMd1d2t1o1s1s2s320001000750500250100第三章結(jié)果與分析3.1葡萄根瘤蚜GSTs基因克隆3.1.1總RNA提取結(jié)果檢測成功從葡萄根瘤蚜成蟲體內(nèi)提取得到總RNA（圖3-1）。經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測，可清晰地見到該RNA的28S，18S和5S三條條帶完整且明亮，并檢測OD260/280值約為1.9。圖3-1葡萄根瘤蚜成蟲總RNA提取電泳圖M：DNA分子量標準,W：全蟲Fig.3-1TheRNAoftissuesextractedfromD.vitifoliaeM：DNAMarker,W：Wholeinsect3.1.2葡萄根瘤蚜GSTs基因cDNA片段的克隆以葡萄根瘤蚜成蟲的cDNA為模板，并使用特異性引物對葡萄根瘤蚜DviGSTd1、DviGSTd2、DviGSTt1、DviGSTo1、DviGSTs1、DviGSTs2和DviGSTs3的開放閱讀框進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖3-2），結(jié)果顯示DviGSTs基因約在600-750bp處有明顯的目的條帶，與GenBank中發(fā)布的葡萄根瘤蚜GSTs基因的核苷酸序列長度基本一致。圖3-2葡萄根瘤蚜GSTs基因片段的擴增結(jié)果Fig3-2AmplificationresultoftheDviGSTsgenefragment
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Effects of intercropping vines with tobacco and root extracts of tobacco on grape phylloxera, Daktulosphaira vitifoliae Fitch[J]. WANG Zhong-yue,SU Jun-ping,LIU Wei-wei,GUO Yu-yuan. Journal of Integrative Agriculture. 2015(07)
[2]葡萄根瘤蚜生物型和遺傳多樣性研究進展[J]. 孫慶華,杜遠鵬,王兆順,翟衡. 果樹學報. 2012(01)
[3]上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)葡萄根瘤蚜危害[J]. 葉軍,鄭建中,唐國良. 植物檢疫. 2006(02)
博士論文
[1]葡萄根瘤蚜嗅覺相關(guān)蛋白的鑒定與功能研究[D]. 趙晶晶.西北農(nóng)林科技大學 2018
[2]梨小食心蟲識別寄主植物揮發(fā)物的分子機制[D]. 李廣偉.西北農(nóng)林科技大學 2016
[3]棉鈴蟲嗅覺相關(guān)蛋白的鑒定及功能研究[D]. 張?zhí)鞚?西北農(nóng)林科技大學 2011
本文編號：3342843
【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：72 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
昆蟲GSTs與人類PiGST的比較（Kettermanetal.2011）
西北農(nóng)林科技大學碩士學位論文81.3.3谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的功能概述GSTs是絕大多數(shù)生物體中發(fā)現(xiàn)的第二階段解毒酶的一個主要家族，其抗藥性的主要機制如圖1-2所示。第一種情況是GSTs催化底物GSH與殺蟲劑進行結(jié)合，產(chǎn)生毒性較小的可溶性結(jié)合物（圖1-2a）。第二種情況是GSTs參與DDT的解毒過程，主要形式為以GSH作為協(xié)同因子，共同催化DDT，將其直接代謝為無毒的DDE（圖1-2b）。在圖1-2c中是第三種情況，昆蟲攝入殺蟲劑后會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，GSTs可顯示過氧化物酶活性，從而減少該反應(yīng)過程中產(chǎn)生有毒的過氧化物。同時GSTs也可通過殺蟲劑的非催化被動結(jié)合產(chǎn)生抗性（圖1-2d）。在昆蟲的整個解毒過程中GSTs參與的代謝抗性分為兩種情況：直接代謝和間接代謝，其中間接代謝是指代謝由其他解毒酶（如P450s和CCEs）產(chǎn)生的次級產(chǎn)物。該酶最著名的是谷胱甘肽（GSH）偶聯(lián)反應(yīng)，它們能催化親電的內(nèi)源和外源化合物與谷胱甘肽（GSH）的巰基結(jié)合，這中和了化學物質(zhì)的高活性親核位點，增加了產(chǎn)物的水溶性，從而促進了它從細胞中的排泄（Pavlidietal.2018）。由于GSH存在于高濃度的細胞內(nèi)，GSTs的GSH結(jié)合位點可能總是被占據(jù)，但N-末端結(jié)構(gòu)域中的“活性位點殘基”能與谷胱甘肽的巰基相互作用并激活巰基，因此GSTs對GSH有很高的親和力。在大多數(shù)哺乳動物GSTs中，活性位點殘基是酪氨酸，但在Delta和Epsilon昆蟲GSTs中，這種作用是由絲氨酸殘基執(zhí)行的（Enayatietal.2005）。圖1-2GSTs介導的抗藥性的主要機制（Pavlidietal.2018）Fig1-2ThemainmechanismofGSTs-mediatedresistance（Pavlidietal.2018）
西北農(nóng)林科技大學碩士學位論文28bpMWbpMd1d2t1o1s1s2s320001000750500250100第三章結(jié)果與分析3.1葡萄根瘤蚜GSTs基因克隆3.1.1總RNA提取結(jié)果檢測成功從葡萄根瘤蚜成蟲體內(nèi)提取得到總RNA（圖3-1）。經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測，可清晰地見到該RNA的28S，18S和5S三條條帶完整且明亮，并檢測OD260/280值約為1.9。圖3-1葡萄根瘤蚜成蟲總RNA提取電泳圖M：DNA分子量標準,W：全蟲Fig.3-1TheRNAoftissuesextractedfromD.vitifoliaeM：DNAMarker,W：Wholeinsect3.1.2葡萄根瘤蚜GSTs基因cDNA片段的克隆以葡萄根瘤蚜成蟲的cDNA為模板，并使用特異性引物對葡萄根瘤蚜DviGSTd1、DviGSTd2、DviGSTt1、DviGSTo1、DviGSTs1、DviGSTs2和DviGSTs3的開放閱讀框進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖3-2），結(jié)果顯示DviGSTs基因約在600-750bp處有明顯的目的條帶，與GenBank中發(fā)布的葡萄根瘤蚜GSTs基因的核苷酸序列長度基本一致。圖3-2葡萄根瘤蚜GSTs基因片段的擴增結(jié)果Fig3-2AmplificationresultoftheDviGSTsgenefragment
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Effects of intercropping vines with tobacco and root extracts of tobacco on grape phylloxera, Daktulosphaira vitifoliae Fitch[J]. WANG Zhong-yue,SU Jun-ping,LIU Wei-wei,GUO Yu-yuan. Journal of Integrative Agriculture. 2015(07)
[2]葡萄根瘤蚜生物型和遺傳多樣性研究進展[J]. 孫慶華,杜遠鵬,王兆順,翟衡. 果樹學報. 2012(01)
[3]上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)葡萄根瘤蚜危害[J]. 葉軍,鄭建中,唐國良. 植物檢疫. 2006(02)
博士論文
[1]葡萄根瘤蚜嗅覺相關(guān)蛋白的鑒定與功能研究[D]. 趙晶晶.西北農(nóng)林科技大學 2018
[2]梨小食心蟲識別寄主植物揮發(fā)物的分子機制[D]. 李廣偉.西北農(nóng)林科技大學 2016
[3]棉鈴蟲嗅覺相關(guān)蛋白的鑒定及功能研究[D]. 張?zhí)鞚?西北農(nóng)林科技大學 2011
本文編號：3342843
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