為探明生防菌Br-2在分枝列當體內及番茄根圍的定殖能力,采用PEG-CaCl₂介導的原生質體轉化體系將紅色熒光蛋白基因DsRed轉入到菌株Br-2中,并構建其生長曲線,測定其對分枝列當種子萌發(fā)的抑制率,通過共聚焦顯微鏡觀察其在分枝列當莖內及番茄根圍的定殖情況。結果表明:通過原生質體轉化體系得到了標記菌株Br-2-DsRed,繼代培養(yǎng)5代后,其在共聚焦顯微鏡下仍可觀察到亮紅色熒光,經PCR檢測帶有DsRed基因,證明其穩(wěn)定性好。標記菌株Br-2-DsRed與野生菌株Br-2的生長曲線基本一致,對分枝列當種子萌發(fā)的抑制率分別為75.86%和74.14%,無顯著差異。顯微觀察發(fā)現(xiàn),標記菌株Br-2-DsRed接種1 d后即能夠侵染分枝列當?shù)那o部表皮,3 d后主要分布在莖表皮和厚壁細胞間隙,5 d后侵染到厚壁細胞及維管束細胞內部并導致莖部腐爛;而標記菌株Br-2-DsRed不能侵染番茄根尖的內部,主要定殖在番茄根尖表面。 

【文章來源】：植物保護學報. 2017,44(04)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

紅色熒光蛋白標記菌株Br-2-DsRed的穩(wěn)定性分析及驗證Fig.1StabilityanalysisandverificationofBr-2-DsRedstainlabeledwithredfluorescentprotein

oteinA：Br-2-DsRed菌絲形態(tài)；B：Br-2-DsRed孢子形態(tài)；C：轉化子中DsRed的PCR檢測；M：DNA分子量標準；1~3：標記菌株Br-2-DsRed基因組；4：質粒PRHN1；5：野生菌株Br-2基因組。A：MorphologiesofBr-2-DsRedmycelium；B：morpholo-giesofBr-2-DsRedconidiogenouscells；C：detectionofDsRedgeneintransformantgenomesbyPCRamplification；M：DNAmarker；1-3：genomicDNAofBr-2-DsRed；4：plasmidPRHN1；5：genomicDNAofBr-2.2.2標記菌株的生長曲線野生菌株Br-2和標記菌株Br-2-DsRed的生長趨勢基本相同，生長曲線基本重合（圖2）。菌株在培養(yǎng)1~4d為分生孢子的對數(shù)生長期，5~9d為穩(wěn)定生長期，表明野生菌株Br-2進行紅色熒光蛋白標記后，外源質粒PRHN1的存在和紅色熒光蛋白的表達對菌株Br-2的生長無明顯影響。圖2野生菌株Br-2和標記菌株Br-2-DsRed的生長曲線Fig.2ThegrowthcurveofwildstainBr-2andlabeledstainBr-2-DsRed圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準差。Dataaremean±SD.2.3標記菌株對分枝列當種子萌發(fā)的影響將野生菌株Br-2和標記菌株Br-2-DsRed孢子懸浮液加入到萌發(fā)培養(yǎng)的分枝列當種子中，結果發(fā)現(xiàn)2個菌株均能夠顯著抑制分枝列當種子的萌發(fā)，萌發(fā)率分別為25.00%和23.33%，均顯著低于對照（表1）。野生菌株Br-2對分枝列當種子萌發(fā)的抑制率為74.14%，標記菌株Br-2-DsRed的抑制率為75.86%，二者間無顯著差異。表明野生菌株Br-2進行紅色熒光蛋白標記后，對分枝列當種子的抑制作用并未受到不利影響。表1野生菌株Br-2和標記菌株Br-2-DsRed對分枝列當種子萌發(fā)的抑制作用Table1TheinhibitingeffectofBr-2andstainBr-2-DsRedongerminationofOrobancheaegyptiacaseed%菌株StrainBr-2Br-2-DsRed對照CK萌發(fā)率Sproutingrate25.00±2.

細胞和厚壁細胞間隙的標記菌株Br-2-DsRed侵染到細胞內部，維管束和薄壁細胞內分布有大量的Br-2-DsRed菌株，并且細胞開始降解，且莖部細胞逐漸降解并出現(xiàn)腐爛狀態(tài)（圖3-D）。共聚焦顯微鏡觀察標記菌株Br-2-DsRed在番茄根尖的定殖情況發(fā)現(xiàn)，接種1~15d后Br-2-DsRed菌株在番茄根部的分布情況一致，主要分布在番茄根尖的表面，并不能侵染到根尖的內部（圖4）。圖3共聚焦顯微鏡觀察標記菌株Br-2-DsRed在分枝列當莖部的定殖情況Fig.3ColonizationimagesofBr-2-DsRedinOrobancheaegyptiacastembytheconfocalmicroscopeA：對照；B~D：接種1、3、5d后Br-2-DsRed菌株分布情況。A：Control；B-D：colonizationimagesofBr-2-DsRedafterin-oculationof1，3，5d.圖4標記菌株Br-2-DsRed在番茄根尖的定殖情況Fig.4ColonizationimagesofBr-2-DsRedontomatoroottipbyconfocalmicroscopeA：對照；B：根表面；C：根內部。A：Control；B：rootsurface；C：rootinternal.3討論生防微生物在植株中定殖、擴散和生存競爭能力是評價其生防潛能的一個重要方面。而DsRed標記技術能夠實時、原位研究微生物的空間定殖、微生物與環(huán)境及宿主的互作，在研究定殖規(guī)律方面具有良好的應用前景（Sarroccoetal.，2007）。但是在對菌株進行熒光標記時，熒光基因的表達是在宿主菌668植物保護學報44卷

【參考文獻】：
期刊論文
[1]枯草芽胞桿菌PTS-394的GFP標記及其定殖能力[J]. 劉郵洲,梁雪杰,喬俊卿,張榮勝,陳志誼.  植物保護學報. 2014(04)
[2]溶桿菌SNNU513基因gfp標記及在玉米根部定殖[J]. 武坤毅,王斐斐,崔浪軍,章華偉,白成科.  中國生物防治學報. 2014(01)
[3]尖孢鐮刀菌古巴�；�4號生理小種紅色熒光蛋白基因轉化[J]. 謝德嘯,羊玉花,周端詠,郭立佳,彭軍,黃小娟,齊興柱,黃俊生.  熱帶作物學報. 2012(04)
[4]短短芽孢桿菌JK-2的GFP標記及其抑菌作用[J]. 車建美,劉波,藍江林.  中國生物防治. 2010(02)
[5]鏈格孢菌原生質體的制備與限制性內切酶介導整合（REMI）轉化的致病性誘變[J]. 伏建國,強勝,朱云枝.  菌物學報. 2005(03)



本文編號：3008038