植物寄生性線(xiàn)蟲(chóng)是引起植物病害的主要病原物之一,其寄主范圍廣、為害嚴(yán)重,每年對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1500多億美元。目前防治植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)仍然以化學(xué)防治為主,但其毒性較大、污染環(huán)境,對(duì)人畜健康存在潛在威脅。隨著高毒農(nóng)藥在我國(guó)的禁用,亟需開(kāi)發(fā)綠色環(huán)保、安全的生防菌來(lái)防治植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)。本研究采集湖南省不同類(lèi)型土壤,并對(duì)土壤中的細(xì)菌進(jìn)行了分離、篩選,獲得了一株對(duì)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)(Ditylenchus destructor)和水稻擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(Meloidogyne graminicola)都具有顯著抑制活性的菌株D45。利用形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定,并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化和對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的殺線(xiàn)蟲(chóng)物質(zhì)進(jìn)行了初步分析。主要研究和結(jié)果如下:1、采用土壤稀釋法,從湖南省張家界、大圍山等土壤較為肥沃、微生物較為豐富且無(wú)人工污染的地區(qū)采集不同類(lèi)型的土壤樣品中分離得到186株細(xì)菌。初篩以馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)為靶標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng),采用直接觸殺法對(duì)土壤分離細(xì)菌進(jìn)行篩選,初篩獲得8株具有較高殺線(xiàn)蟲(chóng)活性的菌株。以擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)為靶標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行復(fù)篩,發(fā)現(xiàn)D45、D54菌株對(duì)擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的活性較高。其中D45菌株發(fā)酵液的殺蟲(chóng)活性最高,其發(fā)酵液上清5倍稀釋液處理24 h、48 h后,馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)和擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的死亡率分別為69.8%、72.1%和60.9%、70.4%。2、盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,菌株D45發(fā)酵液稀釋2倍、5倍后對(duì)水稻擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果分別為79.1%和64.8%。菌株D54發(fā)酵液對(duì)水稻擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果相對(duì)D45較差,其2倍和5倍稀釋液的防治效果分別為66%和45.7%%。田間試驗(yàn)結(jié)果表明,菌株D45發(fā)酵液稀釋2倍、5倍后對(duì)水稻擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果分別為56.3%和53.0%;菌株D54發(fā)酵液稀釋2倍、5倍后對(duì)水稻擬禾本科根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果分別為52.0%和44.3%。3、通過(guò)顯微形態(tài)觀(guān)察,生理生化測(cè)定結(jié)合16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析,鑒定菌株D45為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、D54為阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)。4、采用單因素法對(duì)活性菌株D45發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定其最佳氮碳源的配方為:麥芽糖30g/L、蛋白胨4g/L;最佳發(fā)酵條件為:溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r/min、pH值7.5。5、代謝產(chǎn)物毒力測(cè)試結(jié)果表明,菌株D45發(fā)酵液對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)具有較高的殺蟲(chóng)活性,并可抑制其運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散行為;菌株D45發(fā)酵液揮發(fā)物對(duì)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)有一定的殺線(xiàn)活性。推測(cè)D45菌株代謝活性物質(zhì)中可能存在作用于線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的揮發(fā)性小分子化合物。
【學(xué)位單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S476.1
【部分圖文】：

1492r(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行 16SrDNA 的 PCR 擴(kuò)增。PCR 件:95℃預(yù)變性 2.5min，94℃變性 30S，55℃復(fù)變性 1min，72℃延伸 1min，35 個(gè)72℃延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到 pMD18-T(TaKaRa)克隆載體中，篩選隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將菌株的 16S rDNA 的測(cè)序序列與 GenBank 中已登錄的序列進(jìn)行 BLAST 選取序列相似性較高的典型菌株的基因序列作為參比對(duì)象，應(yīng)用 Mega5.0 的 NeJoining (NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（穩(wěn)定性檢測(cè)重復(fù)取樣 1000 次），進(jìn)行聚類(lèi)分4.3 結(jié)果與分析4.3.1 芽孢桿菌 D45 的鑒定4.3.1.1 高活性菌株 D45 的形態(tài)觀(guān)察鑒定在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上 25℃±1℃培養(yǎng) 24h 的菌落形態(tài)不規(guī)則，邊緣褶皺糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黃色（圖 4-1）。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，D株菌體呈桿狀、端圓（圖 4-2），鞭毛周身。

1492r(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行 16SrDNA 的 PCR 擴(kuò)增。PCR 件:95℃預(yù)變性 2.5min，94℃變性 30S，55℃復(fù)變性 1min，72℃延伸 1min，35 個(gè)72℃延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到 pMD18-T(TaKaRa)克隆載體中，篩選隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將菌株的 16S rDNA 的測(cè)序序列與 GenBank 中已登錄的序列進(jìn)行 BLAST 選取序列相似性較高的典型菌株的基因序列作為參比對(duì)象，應(yīng)用 Mega5.0 的 NeJoining (NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（穩(wěn)定性檢測(cè)重復(fù)取樣 1000 次），進(jìn)行聚類(lèi)分4.3 結(jié)果與分析4.3.1 芽孢桿菌 D45 的鑒定4.3.1.1 高活性菌株 D45 的形態(tài)觀(guān)察鑒定在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上 25℃±1℃培養(yǎng) 24h 的菌落形態(tài)不規(guī)則，邊緣褶皺糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黃色（圖 4-1）。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，D株菌體呈桿狀、端圓（圖 4-2），鞭毛周身。

生防細(xì)菌 D45 的生理生化特性表現(xiàn)為革蘭氏反應(yīng)為陽(yáng)性，可水解淀粉，能與硝酸鹽產(chǎn)生還原反應(yīng)，甲基紅試驗(yàn)為陰性反應(yīng)，能利用過(guò)氧化氫酶，不產(chǎn)硫化氫，具備分解明膠的能力，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)為陽(yáng)性。其特征符合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[58]中關(guān)于芽孢桿菌的描述（表 4-1）。表 4-1 菌株 D45 的部分生理生化特性Table 4-1 Physiological and biochemical characteristics of strain D45測(cè)試項(xiàng)目Items tested特性CharacteristicH2S 試驗(yàn) -甲基紅試驗(yàn) Methyl-red +明膠液化 Gelatin liquefaction +硝酸鹽還原 Nitrate reduction +淀粉水解 Starch hydrolysis +糖氧化發(fā)酵測(cè)定 Sugar fermentation -接觸酶 Catalase +乙酰甲基甲醇 Acetyl methyl carbinol +革蘭氏染色 Gram staining G+
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2853960