天冬氨酸蛋白酶(Aspartic proteases,APs)是一類以天冬氨酸殘基作為催化活性位點(diǎn)的蛋白水解酶,廣泛存在于動(dòng)植物、真菌、細(xì)菌和病毒中。研究表明,APs與動(dòng)物的消化及植物的生長(zhǎng)發(fā)育、真菌及細(xì)菌的侵染致病等過程密切相關(guān)。但APs作為一種表面蛋白與真菌發(fā)育分化及侵染致病的關(guān)系尚不清楚。課題組在研究昆蟲病原真菌球孢白僵菌(分生孢子、芽生孢子和蟲菌體)表面蛋白時(shí),發(fā)現(xiàn)一個(gè)分生孢子表面蛋白BBA_04972在基因組中注釋為真核生物天冬氨酸蛋白酶,命名為CsAP1。本論文利用基因表達(dá)分析、基因破壞及過表達(dá)等方法研究了CsAP1的表達(dá)特性及其與球孢白僵菌發(fā)育分化和侵染致病的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1.CsAP1序列及表達(dá)特性分析序列分析表明,CsAP1的編碼區(qū)全長(zhǎng)1939 bp,包含1個(gè)內(nèi)含子,編碼621個(gè)氨基酸的多肽,推測(cè)分子量為64.815 kDa,等電點(diǎn)為4.39。結(jié)構(gòu)域分析表明,CsAP1屬于天冬氨酸蛋白酶家族,含有2個(gè)天冬氨酸殘基。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),CsAP1序列含有兩種特征性催化指紋“DTGS和DTGT”。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,CsAP1與核盤菌同源蛋白聚為一簇�；虮磉_(dá)特性分析表明,CsAP1在分生孢子中表達(dá)量較高,在蟲體內(nèi)分化的菌體中表達(dá)水平較低,且主要受昆蟲體壁營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)。通過表達(dá)融合P_(gpdA)::CsAP1::eGFP基因觀察發(fā)現(xiàn),融合蛋白僅分布于分生孢子表面,而在其它形態(tài)細(xì)胞中均未觀察到熒光,推測(cè)其可能分泌到胞外。這些研究結(jié)果表明,CsAP1是一個(gè)表面蛋白,可能參與球孢白僵菌對(duì)昆蟲營(yíng)養(yǎng)的利用。2.CsAP1與球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育及分生孢子表面特性形成的關(guān)系為探究CsAP1與球孢白僵菌發(fā)育分化的關(guān)系,分別構(gòu)建了基因破壞(?CsAP1)、過表達(dá)(OE-CsAP1)和回復(fù)互補(bǔ)(Comp)菌株。研究發(fā)現(xiàn),破壞CsAP1不影響菌株生長(zhǎng),但導(dǎo)致分生孢子產(chǎn)量降低。無論是在營(yíng)養(yǎng)貧瘠還是營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上,?CsAP1分生孢子產(chǎn)量顯著低于野生型菌株(WT)(26.7%~76.7%),而OE-CsAP1和Comp的產(chǎn)孢量與WT無明顯差異。由此表明,CsAP1參與分生孢子產(chǎn)生。細(xì)胞表面疏水性測(cè)定結(jié)果表明,破壞CsAP1導(dǎo)致分生孢子疏水性降低(22.93%),而過表達(dá)CsAP1則顯著提高了分生孢子的疏水性(88%)。附著性測(cè)定結(jié)果顯示,OE-CsAP1分生孢子在疏水基質(zhì)上的附著性比WT提高了33.18%~38.32%,在親水基質(zhì)上的附著性比WT降低38.88%~43.18%,而?CsAP1在親水基質(zhì)上的附著性比WT提高了23.67%,Comp在兩種基質(zhì)上的附著性與WT無明顯差異。在弱極性基質(zhì)上,OE-CsAP1分生孢子的附著性比WT降低44.48%~68.26%,而?CsAP1和Comp的附著性與WT無顯著差異。由此推測(cè),CsAP1參與球孢白僵菌分生孢子表面特性形成。3.過表達(dá)CsAP1增強(qiáng)蛋白酶的活性利用脫脂奶粉和酪蛋白平板法測(cè)定球孢白僵菌分泌的蛋白酶活性,結(jié)果顯示,當(dāng)脫脂奶粉或酪蛋白存在時(shí),OE-CsAP1的蛋白透明水解圈與菌落直徑之比(0.69/0.21)顯著大于WT(0.23/0),而?CsAP1和Comp的蛋白透明水解圈與菌落直徑之比與WT無明顯差異。由此表明,過表達(dá)CsAP1提高了胞外蛋白酶的產(chǎn)生。4.CsAP1參與球孢白僵菌對(duì)昆蟲營(yíng)養(yǎng)的利用在昆蟲體壁或血淋巴營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)條件下,?CsAP1氣生菌絲生長(zhǎng)稀疏且生物量積累降低,而OE-CsAP1和Comp與WT無明顯差異。由此推測(cè),CsAP1參與球孢白僵菌對(duì)昆蟲營(yíng)養(yǎng)的利用。5.CsAP1是球孢白僵菌的一個(gè)毒力因子以大蠟螟三齡幼蟲為試蟲,采用體壁浸染和血腔注射兩種接種方式進(jìn)行生物測(cè)定。結(jié)果表明,?CsAP1毒力降低,而OE-CsAP1毒力提高,Comp與WT無明顯差異。蟲菌體生物量測(cè)定結(jié)果顯示,?CsAP1蟲菌體數(shù)量比WT降低了27.21%~50.7%,而OE-CsAP1蟲菌體數(shù)量比WT提高了7.6%~59.5%。由此表明,CsAP1參與昆蟲營(yíng)養(yǎng)利用,影響菌株毒力。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S476.12
【部分圖文】：

子的形式攝取血淋巴中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并大量繁殖；(3)在昆謝產(chǎn)物等逃避宿主的免疫應(yīng)答，致昆蟲死亡；(4)在適宜體壁產(chǎn)生分生孢子進(jìn)入下一輪侵染循環(huán)(圖 1.1) (Pedrinez et al., 2016; Wang and Wang, 2017)。在侵染過程中，降解昆蟲體壁協(xié)助其入侵，如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶為侵染打開通道，同時(shí)也為自身生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Fang(Metarhizium anisopliae)中類枯草桿菌蛋白酶 Pr1 和絲昆蟲體壁過程中發(fā)揮重要作用，Pr2 促進(jìn) Pr1 降解昆蟲化酶表達(dá)，引起黑化反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)昆蟲的免疫應(yīng)答(St Le et al., 2014)。幾丁質(zhì)是昆蟲體壁的主要成分，幾丁質(zhì)酶一個(gè)重要的毒力因子，研究表明，破壞幾丁質(zhì)酶基因會(huì) et al., 1998; Greenfield et al., 2014)。昆蟲表皮最外層蠟脂肪酸和烴類物質(zhì)。其中，不同烴類物質(zhì)促進(jìn)或抑制分響其侵染(Pedrinietal.,2013)。細(xì)胞色素 P450 基因 Bbcy響菌株毒力(Zhang et al., 2012)。

孢白僵菌不同形態(tài)細(xì)胞。(A)透射電鏡觀察球孢白僵菌分生孢子、芽生孢子及蟲菌體細(xì)色觀察球孢白僵菌不同形態(tài)細(xì)胞表面碳源表位(Wanchoo et al., 2009)。(C)透射電鏡觀察 D前后的蟲菌體(Yang et al., 2017)。1.2 Different cell morphologies of B. bassiana. (A) TEM images of high-pressure frod B. bassiana conidia, blastospores and hyphal bodies. (B) DIC and fluorescence images of lecf B. bassiana cell morphologies (Wanchoo et al., 2009). (C) TEM images of B. bassiana hyphal boand following treatment with dithiothreitol DTT or protease K (Yang et al., 2017).菌細(xì)胞表面蛋白胞壁是病原真菌與宿主或外界環(huán)境接觸的第一道屏障，具有保護(hù)細(xì)化學(xué)損傷、排除異物以及其它病原微生物的侵害等作用(Money,1999yhani, 2005; Holder et al., 2007; Lewis et al., 2009)。蛋白是真菌細(xì)胞壁包括細(xì)胞壁合成和降解所需的酶及結(jié)構(gòu)性蛋白等。細(xì)胞壁蛋白與病原及逃避昆蟲免疫識(shí)別密切相關(guān)，如生物被膜形成和昆蟲體表附著等08)。其中，細(xì)胞壁蛋白主要分為兩類，包括與細(xì)胞壁多糖共價(jià)偶聯(lián)

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文病的關(guān)系。課題的開展，將揭示分生孢子表面蛋白的生物學(xué)功能，可為球孢白僵菌致病性機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。2.2 技術(shù)路線本論文擬采用的實(shí)施方案的技術(shù)路線如圖 2.1。
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