放線菌是一類重要的微生物資源,能產(chǎn)生豐富具有活性的次級代謝產(chǎn)物,這些物質(zhì)在植物病害生物防治方面具有廣泛的應用。本實驗室通過前期篩選,獲得了一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的殺真菌鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus),其發(fā)酵液對植物病原真菌具有很好的防治效果,本文圍繞發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)解析展開深入研究,獲得以下結(jié)果:該鏈霉菌經(jīng)液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后,通過離心、濾膜過濾去除菌絲體和培養(yǎng)基組分,收集發(fā)酵液,用XAD-16大孔樹脂對發(fā)酵液中活性物質(zhì)進行吸附,然后用50%甲醇浸泡樹脂,經(jīng)二氯甲烷萃取,收集二氯甲烷相,濃縮后獲得3.1 g粗提物浸膏。對粗提物進行一級硅膠柱層析,共獲得15個不同組分,編號為1~15。以煙草赤星病菌(Alternaria alternata)為指示菌,采用杯碟法對這15個組分進行活性測定,其中有6個組分有活性,用十字交叉法分別測量抑菌圈直徑大小,3號和6號組分的抑菌圈直徑最大,分別為37.2 mm和30.8 mm。3號組分經(jīng)二級硅膠柱層析,Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱層析,獲得一個化合物A3,并通過薄層層析檢測,該物質(zhì)在硅膠板上成單一的色譜點,通過分析型高效液相進行分析,在第19 min時出現(xiàn)了一個單一的峰,判斷該物質(zhì)為單體化合物。6號組分經(jīng)過制備型高效液相色譜反復制備分離,共獲得了4個單體化合物,F1、F2、F3和F8。采用核磁共振、質(zhì)譜等多種結(jié)構(gòu)鑒定方法對上述五個單體化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)合譜圖檢測數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻數(shù)據(jù),確定這5個化合物中,A3、F1、F2和F3為已知化合物,分別是:鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate)、環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)二肽(Cyclo-(Phe-Pro))、環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)二肽(Cyclo-(Pro-Leu))、環(huán)(脯氨酸-異亮氨酸)二肽(Cyclo-(Pro-Ile));通過SCI Finder數(shù)據(jù)庫查找,發(fā)現(xiàn)沒有與F8結(jié)構(gòu)一致的化合物,因此將化合物F8鑒定為新的天然產(chǎn)物,將其命名為6-(5-hydroxy-6-methylheptyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-one。采用96孔板微量稀釋法對5個化合物抗植物病原真菌活性進行研究,結(jié)果表明,5個化合物均有抗煙草赤星病菌活性,且化合物A3和F8的抑菌活性較好,其IC_(50)分別為22.9μg/mL和20.8μg/mL。此外,這也是該類化合物在防治煙草赤星病害上的首次報道。通過單因子試驗明確了鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中最適碳源和氮源,分別是淀粉和花生餅粉。利用Plackett-Burman試驗篩選出培養(yǎng)基中對活性物質(zhì)產(chǎn)生影響較大的成分,分別是淀粉和硫酸銨;同時利用響應面法,選取淀粉、花生餅粉和硫酸銨這三個因素進行Box-Behnken實驗設(shè)計,通過多元回歸分析,得到三種成分優(yōu)化后的濃度分別為,淀粉27.15 g/L,花生餅粉27.88 g/L,硫酸銨0.72 g/L,優(yōu)化后的發(fā)酵液抑菌圈直徑的平均值為33.05 mm,較優(yōu)化之前提高了31.2%。利用簡并引物,對鏈霉菌進行Ⅰ型聚酮合酶(PKS-Ⅰ)、Ⅱ型聚酮合酶(PKS-Ⅱ)和非核糖體肽合成酶(NRPS)功能基因的擴增,評估其可能產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物的類別,結(jié)果表明,該菌株分別含有PKS-Ⅰ和NRPS相關(guān)基因,具有催化產(chǎn)生聚酮類化合物和非核糖體肽類物質(zhì)的潛力。
【學位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S476.1
【部分圖文】：

2-1 菌株液體發(fā)酵上清液對煙草赤星病菌的抑制g.2-1 Inhibition of the liquid fermentation on A.alte菌株粗提物的制備和抑菌活性測定發(fā)酵培養(yǎng)，通過離心、濾膜過濾去除菌絲對發(fā)酵液中活性物質(zhì)進行吸附，收集樹脂蒸發(fā)儀進行濃縮，共獲得粗提物的總的浸行反復萃取，獲得 3.1 g 粗提物。采用牛津菌活性，共三次重復，具體結(jié)果如下圖 2無菌水粗提物

圖 2-1 菌株液體發(fā)酵上清液對煙草赤星病菌的抑制作用Fig.2-1 Inhibition of the liquid fermentation on A.alternate菌菌株粗提物的制備和抑菌活性測定行發(fā)酵培養(yǎng)，通過離心、濾膜過濾去除菌絲體和脂對發(fā)酵液中活性物質(zhì)進行吸附，收集樹脂，甲轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，共獲得粗提物的總的浸膏 2進行反復萃取，獲得 3.1 g 粗提物。采用牛津杯抑菌活性，共三次重復，具體結(jié)果如下圖 2-2。上清液 無菌水

圖 2-3 菌株粗提物薄層層析檢測結(jié)果Fig.2-3 The TLC results of crude extraction2.2.4 粗提物一級硅膠柱層析分離和各組分薄層層析檢測根據(jù)對粗提物薄層層析的結(jié)果，試驗選用二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑，采用梯度洗脫法，共進行了 6 個梯度的洗脫，共收集 40 個樣品。它們分別是 A1~8、B1~8、C1~8、D1~8、E1~7、F，將粗提物作為對照，與這 40 個樣品一起進行薄層層析，結(jié)果如下：

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本文編號：2811244