黑磷(BP)作為新型二維材料以其優(yōu)異的性能在許多領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景,目前以有報(bào)道發(fā)現(xiàn)BP可以抑制細(xì)胞生長,但它對(duì)環(huán)境的影響尚未得到足夠的重視。本研究以黑磷塊為研究原料,通過超聲剝離法對(duì)其進(jìn)行剝離獲得BP納米片,從BP納米片對(duì)純培養(yǎng)細(xì)菌的毒性、對(duì)土壤酶活及其土壤細(xì)菌多樣性和豐度的影響等角度,探究了BP對(duì)細(xì)菌的生物毒性。在BP的細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)中,選擇革蘭氏陽性菌B.subtilis和革蘭氏陰性菌E.coli作為受試對(duì)象,添加不同濃度的BP(0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL),探究BP對(duì)純培養(yǎng)細(xì)菌的毒性及毒性產(chǎn)生原因。通過監(jiān)測細(xì)菌生長曲線及平板涂布兩種方法發(fā)現(xiàn),BP可以有效的抑制純培養(yǎng)細(xì)菌的生長,處理6 h時(shí),BP對(duì)革蘭氏陰性E.coli的毒性比革蘭氏陽性B.subtilis高,但對(duì)E.coli所表現(xiàn)出的毒性在12 h時(shí)顯著降低。BP所表現(xiàn)出的細(xì)菌毒性呈濃度依賴性,對(duì)B.subtilis還具有時(shí)間依賴性,暴露12 h后BP對(duì)E.coli和B.subtilis的最大殺菌效率分別為88.76%和99.69%。通過探針標(biāo)記和SEM電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)BP通過在細(xì)菌內(nèi)部產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)和破壞細(xì)胞的完整性這兩種方式抑制細(xì)菌生長。在土壤實(shí)驗(yàn)中,添加不同濃度BP(0 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg),以有機(jī)質(zhì)含量較高的黑土和有機(jī)質(zhì)含量相對(duì)較低的棕壤作為受試對(duì)象,通過探究BP在不同土壤類型中對(duì)土壤酶活和細(xì)菌多樣性的影響我們發(fā)現(xiàn),在土壤酶活方面,在黑土培養(yǎng)初期(10d),不同濃度BP均表現(xiàn)出抑制土壤脲酶活性、促進(jìn)了過氧化氫酶活性的趨勢,隨濃度增大作用效果增強(qiáng),但差異不顯著,培養(yǎng)到30 d時(shí),黑土中土壤酶活性相繼恢復(fù),整個(gè)培養(yǎng)過程中添加不同濃度BP處理對(duì)土壤脲酶,過氧化氫酶以及酸性磷酸酶活性影響差異不顯著;在棕壤培養(yǎng)初期(10d),不同濃度BP顯著的抑制了棕壤脲酶活性,同時(shí)顯著促進(jìn)了過氧化氫酶活性,且均有濃度依賴性,培養(yǎng)30 d后其不同土壤酶活性同樣開始恢復(fù),整個(gè)過程中對(duì)中性磷酸酶影響差異不顯著;對(duì)比BP在兩種土壤中對(duì)酶活的影響發(fā)現(xiàn),棕壤的土壤酶活對(duì)BP的響應(yīng)比黑土的敏感。在pH變化方面,和空白土壤樣本相比,BP可以顯著降低棕壤培養(yǎng)末期(60d)的pH值,但對(duì)黑土的pH值影響差異不顯著�；诟咄繙y序結(jié)合qPCR技術(shù)研究BP對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和豐度的影響,結(jié)果表明,添加BP可以降低兩種土壤細(xì)菌豐富度,在培養(yǎng)初期(10 d)對(duì)棕壤影響較為顯著,但在培養(yǎng)后期影響差異不顯著;整個(gè)培養(yǎng)過程中,BP對(duì)黑土細(xì)菌豐富度影響差異不顯著;BP在培養(yǎng)初期可以促進(jìn)黑土中放線菌門的生長,在培養(yǎng)末期酸桿菌門相對(duì)豐度在處理樣本中顯著高于空白樣本,而BP對(duì)棕壤中擬桿菌門的生長具有抑制作用。屬水平上,BP可以促進(jìn)土壤中部分磷代謝微生物活性,如假單胞菌屬、芽單胞菌屬等。在細(xì)菌豐度中,BP在不同時(shí)期對(duì)細(xì)菌豐度影響差異不顯著。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),50 mg/kg的BP添加量不會(huì)明顯改變土壤細(xì)菌群落多樣性。綜上所述,BP可以通過ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和破壞細(xì)胞膜完整性兩方面共同作用對(duì)革蘭氏陰性菌E.coli和革蘭氏陽性菌B.subtilis造成毒性;在土壤酶活方面,BP可以顯著抑制棕壤土壤脲酶,促進(jìn)過氧化氫酶酶活性,并表現(xiàn)出濃度依賴性,由于黑土有機(jī)質(zhì)含量較高,BP對(duì)黑土土壤酶活影響差異不顯著;在細(xì)菌多樣性方面,50 mg/kg的BP添加量可以顯著降低初期棕壤土壤細(xì)菌豐富度,而整個(gè)培養(yǎng)過程中對(duì)到黑土土壤細(xì)菌多樣性影響差異不顯著。
【學(xué)位單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S154
【部分圖文】：

3 結(jié)果與分析3.1 黑磷對(duì)純培養(yǎng)細(xì)菌生物毒性微生物廣泛存在與環(huán)境，參與環(huán)境中不同代謝循環(huán)[69]。通過研究 BP 對(duì)純培養(yǎng)微生的毒性行為，可以更好的評(píng)價(jià) BP 在環(huán)境中的生物學(xué)效應(yīng)。E.coli 廣泛存在于環(huán)境中，且被作為模式菌株用于指示不同材料的生物學(xué)毒性[70, 71]，因此我們選取革蘭氏陰性菌 E.c及同為桿狀細(xì)菌的革蘭氏陽性菌 B. subtilis 作為受試對(duì)象，探究 BP 的微生物毒性。3.1.1 黑磷的剝離及表征在無氧水中通過超聲剝離法成功制備 BP 納米片，如顯微鏡圖像所示(圖 3-1 a-c)，剝的 BP 納米片分散良好，通過 AFM 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可知，所剝離獲得 BP 的平均寬度厚度分別為 215.84 ± 82.09 和 1.58 ± 1.23 nm(圖 3-1 f,g)。通過 DLS 分析發(fā)現(xiàn)，所制備 的平均粒徑大小為 214 nm，表面電位為-17 mv (圖 3-1 d,e)。

圖 3-2 不同濃度對(duì)的細(xì)菌毒性 E. coli (a)和 B. subtilis (b)在暴露在不同濃度 BP 下，37 °C 下培養(yǎng) 12 h 的生長曲線以及 BP 對(duì) E. coli (c)和 B. subtilis (d)在 6h 和 12h 的抑制率(*和***分別表示 P < 0.05 和 P <0.001)Figure 3-2 Bacterial toxicity of different concentrations of BP nanosheets. Growth curve of E. coli (a) and B.subtilis (b) exposed to different concentrations of BP nanosheets at 37 °C for 12 h in LB medium; Theinhibition rate of BP nanosheets against E. coli (c) and B. subtilis (d) at 6 h and 12 h (* and *** indicate P <0.05 and P < 0.001, respectively)為了進(jìn)一步探究 BP 對(duì)細(xì)菌的毒性效果，采用平板涂布法研究 BP 對(duì)活細(xì)菌的殺菌效果(圖 3-3)。從圖中可以清晰的發(fā)現(xiàn)，隨著 BP 濃度的增加，兩種細(xì)菌通過平板涂布所得菌落數(shù)明顯減少(P < 0.01)。BP 的殺菌效果和生長曲線表現(xiàn)出一致的規(guī)律，對(duì)于 E. coli 在 6 h暫時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌效果，高濃度下殺菌率分別為 90.77 ± 0.39% (50 μg/mL)和 98.92 ±0.16% (100 μg/mL)，在培養(yǎng) 12 h后，BP 的殺菌效果降低至71.87 ± 2.88% (50 μg/mL)和91.65± 2.14% (100 μg/mL) (圖 3-3 i)。對(duì)比 E. coli，從 B. subtilis 的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)，BP 對(duì)與 B.

圖 3-3 不同濃度黑磷的殺菌效率 0 μg/mL (a, e, j, n), 10 μg/mL (b, f, k, o), 50 μg/mL (c, g, l, p)和 100μg/mL (d, h, m, q)濃度下的 BP 處理 E. coli (a-h)和 B. subtilis (j-q)所得 6 h (a-d, j-m)和 12 h (e-h, n-q)的平板照片以及 BP 對(duì) E. coli (i)和 B. subtilis (r)殺菌效率統(tǒng)計(jì)(**和***分別表示 P < 0.01 和 P < 0.001)Figure 3-3 The concentration-dependent bactericidal effects of BP nanosheets after 6 and 12 h treatment.Photographs of agar plates of E. coli (a-h) and B. subtilis (j-q) after incubation with 0 μg/mL (a, e, j, n), 10μg/mL (b, f, k, o), 50 μg/mL (c, g, l, p), and 100 μg/mL (d, h, m, q) of BP nanosheets. The bactericidalefficiency of BP nanosheets towards E. coli (i) and B. subtilis (r) calculated from colony counting. (** and ***indicate P < 0.01 and P < 0.001, respectively)通過測定 BP 在 OD 600 nm 處吸光度繪制 BP 的降解曲線(圖 3-4)，從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，BP 在 600 nm 處的吸光度隨時(shí)間進(jìn)行而呈現(xiàn)下降趨勢，這也進(jìn)一步解釋了 BP 在培養(yǎng)前所產(chǎn)生毒性較強(qiáng)而后期其毒性降低。

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