核盤菌引起的菌核病是一種世界性分布的重要農(nóng)作物病害,盾殼霉是核盤菌上的重寄生真菌。目前,關(guān)于盾殼霉和核盤菌互作的研究,大多是從基因和蛋白層面獲得的,而在代謝水平上的研究甚少。為了研究盾殼霉寄生核盤菌過程中的關(guān)鍵代謝物,本研究采用基于LC-MS的代謝組學(xué)手段,分析敲除盾殼霉的NOX相關(guān)基因后,失去寄生能力的突變株的代謝變化,以及盾殼霉寄生核盤菌過程中的差異代謝物質(zhì)種類,找到寄生關(guān)鍵代謝物并分析其可能的生物功能,取得的主要結(jié)果如下:1盾殼霉突變株Qnox1-6的代謝特性。通過失去寄生能力的突變株Qnox1-6與野生株zs-1的代謝比較,發(fā)現(xiàn)敲除NOX相關(guān)基因后,能夠引起盾殼霉中大量代謝物顯著上調(diào)。通過采集不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的代謝樣品,比較重復(fù)出現(xiàn)的代謝差異物質(zhì),得到14個(gè)共同差異物質(zhì),大部分為羧酸類和苷類物質(zhì),且在突變株中均顯著上調(diào),特別的是,有7種代謝物僅出現(xiàn)在突變株中,包括松柏苷(抗氧化物質(zhì))、3個(gè)羧酸類物質(zhì)、1個(gè)酚類物質(zhì)、1個(gè)甾體皂苷類物質(zhì)和1個(gè)其它物質(zhì)。分析認(rèn)為敲除NOX相關(guān)基因后,除了會(huì)引起盾殼霉突變株代謝抗氧化類物質(zhì),還會(huì)導(dǎo)致其代謝其它新的次級(jí)代謝產(chǎn)物,這些物質(zhì)與盾殼霉的細(xì)胞分化和分生孢子的形成密切相關(guān)。2盾殼霉寄生核盤菌的關(guān)鍵代謝物篩選。通過盾殼霉和核盤菌的共培養(yǎng)分別與兩種菌株單獨(dú)培養(yǎng)相比,代謝總離子流圖結(jié)果顯示,盾殼霉在接觸到核盤菌之后有明顯的代謝擾動(dòng)。兩組比較發(fā)現(xiàn),共同的差異代謝組分有52個(gè),大部分為酸類和苷類物質(zhì)。差異組分的靶向代謝通路富集結(jié)果顯示有10種代謝路徑顯著富集。其中:氨基酸相關(guān)通路,甘油磷脂代謝和谷胱甘肽代謝通路的顯著富集,說明在寄生過程中菌體的生命活動(dòng)旺盛,寄生過程涉及很多復(fù)雜生命活動(dòng)相關(guān)代謝物的產(chǎn)生,此過程有較復(fù)雜的信號(hào)分子傳導(dǎo),還涉及細(xì)胞的凋亡,菌體間通過甘油磷脂類物質(zhì)的代謝來進(jìn)行相互識(shí)別,同時(shí),磷脂類物質(zhì)也可能參與寄生過程的防御反應(yīng)中。為了進(jìn)一步縮小寄生引起的代謝差異物質(zhì)的范圍,引入盾殼霉突變株Qnox1-6與核盤菌共培養(yǎng)的不寄生組進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。通過多組分比較篩選,以及代謝組分在各處理組中的代謝峰相對(duì)豐度比較和生物學(xué)功能分析,篩選認(rèn)為2-Phenylacetamide和Sinapic acid是盾殼霉寄生核盤菌的關(guān)鍵物質(zhì)。3寄生關(guān)鍵代謝物的生物功能研究。以芥子酸(S.A.)為外源添加對(duì)象的實(shí)驗(yàn)證明:S.A.的添加對(duì)盾殼霉生長(zhǎng)影響較小;但是,S.A.能明顯抑制核盤菌的生長(zhǎng)并導(dǎo)致其出現(xiàn)生長(zhǎng)異�，F(xiàn)象。代謝通路富集結(jié)果顯示,低濃度S.A.的添加導(dǎo)致核盤菌細(xì)胞內(nèi)正常氧化還原及能量代謝受阻,故而引起NAD補(bǔ)救途徑的顯著上調(diào),且高濃度的S.A.對(duì)核盤菌的磷脂合成代謝路徑有抑制,分析認(rèn)為S.A.影響到核盤菌細(xì)胞膜的生物功能,導(dǎo)致其出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢,生長(zhǎng)異常等現(xiàn)象。S.A.添加對(duì)寄生組共培養(yǎng)過程的代謝影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與未添加共培養(yǎng)組相比,S.A.的添加會(huì)引起共培養(yǎng)過程中酸類,糖苷類,酚類、酰胺類等物質(zhì)的顯著上調(diào)。說明S.A.的添加對(duì)共培養(yǎng)產(chǎn)生的差異代謝有加強(qiáng)的效果,除此之外,代謝通路富集結(jié)果表明,S.A.的添加還會(huì)影響到盾殼霉接觸核盤菌時(shí)的能量代謝以及細(xì)胞識(shí)別與信號(hào)分子的傳導(dǎo)等功能,進(jìn)一步證明了 S.A.是盾殼霉接觸核盤菌的過程中的關(guān)鍵代謝物。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S432.44
【部分圖文】：

邐ｎｍｒ邋＾邐，邋ＤＡＴＡ＾；邐邐逡逑、魏邋／逡逑圖１－４代謝組學(xué)研究中的不同的信息技術(shù)與分析方法簡(jiǎn)圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ａ邋ｇｒａｐｈｉｃａｌ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｎａｌｙｔｉｃａｌ邋ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ邋ａｎｄ邋ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ逡逑ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ邋ｅｍｐｌｏｙｅｄ邋ｉｎ邋ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ邋ｓｔｕｄｉｅｓ逡逑８逡逑

圖２－１盾殼霉生長(zhǎng)形態(tài)圖。左圖為野生株，右圖為突變株逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｍｏｉｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ邋ｍｉｎｉｔａｎｓ．邋Ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ邋ｆｏｒ邋ｗｉｌｄ邋ｓｔｒａｉｎｓ，邋ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｍｕｔａｎｔ邋ｓｔｒａｉｎｓ逡逑圖２－１中盾殼霉野生株ｚｓ－ｌ表面有明顯的黑色分生孢子，而突變株Ｑｎｏｘｌ－６表面則逡逑無成熟的分生孢子器和分生孢子生成。對(duì)野生盾殼霉菌株ｚｓ－１邋（對(duì)照組）和喪失寄生逡逑能力的突變株Ｑｎｏｘｌ－６代謝物樣品進(jìn)行ＬＣ－ＭＳ分析，圖２－２是培養(yǎng)１０天的代謝樣品在逡逑正離子模式下的總離子流圖。培養(yǎng)１０天的樣品中檢測(cè)到５６３個(gè)代謝特征峰（由質(zhì)荷比逡逑和保留時(shí)間組成的數(shù)據(jù)對(duì)統(tǒng)計(jì)得到），由總離子流圖可以看到，突變株與野生株相逡逑比，有明顯的代謝物差異，保留時(shí)間在６－ｌＯｍｉｎ之間物質(zhì)特征峰顯著下調(diào)，且有新的逡逑和顯著上調(diào)的物質(zhì)特征峰出現(xiàn)（紅色箭頭所示）。逡逑２．５ｘｌ0５邐N逡逑？Ｓ邋２．０Ｘ１０５－邐、邐，邐Ｉ！邐＾邐ｉｎ邋．邋＾邐，逡逑Ｃ邋１．５ｘ１０ｓ－邐＼邐：邐＼邋Ｉ邋１邐ｌ0ｄ邋Ｑｎｏｘｌ－６逡逑名邋ｌ．ＯｘｌＯ５．邐１邐ｆ邋，邋Ｉ邋；邐＼邋＊逡逑０邐２邐４邐６邐８邐１０邐１２邐１４邐１６邐１８邐２０邐２２邐２４逡逑Ｒｅｔｅｎｔｉｎ邋Ｔｉｍｅ／（ｍｉｎ）逡逑２．０ｘｌ０５邋－邐｜｜逡逑？ｉ邋ｎ丨丨Ｊ邋ｈ邋，ｄｚｓ＿ｌ逡逑＝５0ｘ；°（｜＇邐ＪＪＵｗＵＵｌＷ１邋ＬＪＬＪｕｊｕＩｗｖ＾＾—逡逑（Ｉ邋ｌｌ邋＿邐＿邐＿邐＿邐Ｍ邐■邐

２結(jié)果與分析逡逑２．１菌株培養(yǎng)及代謝差異分析逡逑圖２－１盾殼霉生長(zhǎng)形態(tài)圖。左圖為野生株，右圖為突變株逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｍｏｉｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ邋ｍｉｎｉｔａｎｓ．邋Ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ邋ｆｏｒ邋ｗｉｌｄ邋ｓｔｒａｉｎｓ，邋ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｍｕｔａｎｔ邋ｓｔｒａｉｎｓ逡逑圖２－１中盾殼霉野生株ｚｓ－ｌ表面有明顯的黑色分生孢子，而突變株Ｑｎｏｘｌ－６表面則逡逑無成熟的分生孢子器和分生孢子生成。對(duì)野生盾殼霉菌株ｚｓ－１邋（對(duì)照組）和喪失寄生逡逑能力的突變株Ｑｎｏｘｌ－６代謝物樣品進(jìn)行ＬＣ－ＭＳ分析，圖２－２是培養(yǎng)１０天的代謝樣品在逡逑正離子模式下的總離子流圖。培養(yǎng)１０天的樣品中檢測(cè)到５６３個(gè)代謝特征峰（由質(zhì)荷比逡逑和保留時(shí)間組成的數(shù)據(jù)對(duì)統(tǒng)計(jì)得到），由總離子流圖可以看到，突變株與野生株相逡逑比，有明顯的代謝物差異，保留時(shí)間在６－ｌＯｍｉｎ之間物質(zhì)特征峰顯著下調(diào)，且有新的逡逑和顯著上調(diào)的物質(zhì)特征峰出現(xiàn)（紅色箭頭所示）。逡逑２．５ｘｌ0５邐N逡逑？Ｓ邋２．０Ｘ１０５－邐、邐，邐Ｉ！邐＾邐ｉｎ邋．邋＾邐，逡逑Ｃ邋１．５ｘ１０ｓ－邐＼邐：邐＼邋Ｉ邋１邐ｌ0ｄ邋Ｑｎｏｘｌ－６逡逑名邋ｌ．ＯｘｌＯ５．邐１邐ｆ邋

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2808935