【摘要】：本文在國家自然科學(xué)基金項目(No.31372159)資助下,以中國農(nóng)田蜘蛛中的常年優(yōu)勢種——擬環(huán)紋豹蛛(Pardosa pseudoannulata)(Araneae:Lycosidae)及其獵物為研究對象,通過宏觀與微觀相結(jié)合的模式,探求了農(nóng)田蜘蛛在不同環(huán)境條件下的攝食行為、消化速率、食譜及其量化控蟲效率。采用單因素分析法和三水平三因素正交實驗法,對環(huán)境照度、顏色和溫度等影響擬環(huán)紋豹蛛捕食效率的宏觀因素進行了分析;應(yīng)用終點PCR(End-point PCR)、實時熒光PCR(Real-time PCR)、DNA條形碼(DNA barcode)、二代測序(Next Generation Sequencing,NGS)和數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR)等前沿分子生物學(xué)手段,從微觀角度對擬環(huán)紋豹蛛的消化效率、不同生境下的獵物譜進行了測定,并建立了擬環(huán)紋豹蛛在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中對褐飛虱、灰飛虱、稻縱卷葉螟、麥長管蚜、黑尾葉蟬這五類主要稻田害蟲精確捕食量的實驗方法,對狼蛛這類天敵在田間不易直接觀察統(tǒng)計其捕食種類和數(shù)量的難題進行了探討。主要研究結(jié)果總結(jié)如下:(1)宏觀上,分析了不同環(huán)境因素對擬環(huán)紋豹蛛捕食獵物效率的影響。單因素實驗結(jié)果表明,環(huán)境條件分別為10 Lx、紅色、27℃時狼蛛捕食行為最為活躍。為模擬農(nóng)田自然生境,采用正交實驗L_9(3~3),以判斷多種環(huán)境因素對狼蛛捕食效率的綜合影響。實驗結(jié)果顯示,極差R最大的是環(huán)境溫度,在優(yōu)化組合15 Lx-綠色-27℃的條件下擬環(huán)紋豹蛛的捕食行為最為活躍,捕食效率最高。由此可見,擬環(huán)紋豹蛛的捕食策略和行為與環(huán)境因子相適應(yīng),是該物種在長期進化過程中與其生存環(huán)境不斷磨合的結(jié)果。(2)微觀上,采用終點PCR法檢測了擬環(huán)紋豹蛛捕食黑腹果蠅后的消化速度,結(jié)果顯示,當進食16 h后,擬環(huán)紋豹蛛消化道內(nèi)所殘留的黑腹果蠅已經(jīng)很少,24 h后檢測不到獵物的殘留DNA。隨后進一步采用終點PCR法結(jié)合實時熒光PCR法兩種實驗手段,在不同消化時間和消化溫度條件下,對擬環(huán)紋豹蛛捕食褐飛虱后的衰減/消化效率進行檢測。結(jié)果顯示,捕食后1 h~2 h內(nèi)擬環(huán)紋豹蛛頭胸部消化道(吸胃)內(nèi)褐飛虱DNA殘留量相對穩(wěn)定,2 h后蜘蛛頭胸部的吸胃內(nèi)褐飛虱DNA含量出現(xiàn)衰減,之后其衰減速率不斷加快,4 h之后衰減速率趨于平緩;蜘蛛捕食2 h后,褐飛虱體液開始大量進入腹部并消化,消化速率在4 h時最快,但8 h之后趨于平緩。消化溫度對擬環(huán)紋豹蛛頭胸部消化道內(nèi)褐飛虱DNA含量影響不大,而腹部消化道內(nèi)褐飛虱DNA含量在26℃時消化速率最快,并隨溫度升高消化速率逐漸減慢;但結(jié)合終點PCR法和實時熒光PCR法結(jié)果來看,狼蛛在28℃±2℃的環(huán)境條件下都能較好的消化獵物。(3)采用二代測序的方法對濕地、茶園、高山草甸、稻田四種生境中擬環(huán)紋豹蛛的天然食性進行了分析。結(jié)果表明,在調(diào)查樣地環(huán)境中擬環(huán)紋豹蛛以捕食鞘翅目和雙翅目昆蟲為主,獵物譜極廣,此次調(diào)查的四種生境中共檢測出昆蟲綱的7個目、24個科。同時,發(fā)現(xiàn)蜘蛛所生存的環(huán)境、季節(jié)對其食物多樣性的影響極大:生境的差異決定了蜘蛛食譜的多樣性,蜘蛛獵物食譜豐富度總的趨勢為:中低海拔生境高海拔生境;生物群落多樣性高的生境群落單一生境;未使用農(nóng)藥的生境使用過農(nóng)藥的生境;濕地旱地;農(nóng)作物生長中后期收割、換茬期。(4)采用數(shù)字PCR技術(shù)對擬環(huán)紋豹蛛的食性進行定量分析。通過對湖南省農(nóng)業(yè)科研究院未施藥稻田進行害蟲樣本的隨機采集,以COI為目標基因設(shè)計通用引物,對采集的9類害蟲進行了DNA條形碼鑒定,檢測到該稻田的主要害蟲為褐飛虱、灰飛虱、稻縱卷葉螟、麥長管蚜、黑尾葉蟬。在人工干預(yù)下,以上述5種害蟲為獵物過量喂食擬環(huán)紋豹蛛,得到擬環(huán)紋豹蛛在24 h內(nèi)能捕食的最大獵物數(shù)。使用數(shù)字PCR測得的陽性微滴數(shù)對自然條件下采集的擬環(huán)紋豹蛛的捕食量進行測算。通過數(shù)學(xué)建模計算得出,平均每頭擬環(huán)紋豹蛛捕食了褐飛虱2.64頭、灰飛虱2.14頭、稻縱卷葉螟0.16頭、麥長管蚜1.02頭、黑尾葉蟬0.2頭�？紤]到獵物核酸在蜘蛛消化道內(nèi)被漸漸降解,導(dǎo)致一些DNA無法進行PCR擴增;以及擬環(huán)紋豹蛛天性兇狠,如遇獵物太多,采取先殺死但暫不進食的策略等干擾因素,可見擬環(huán)紋豹蛛的實際控蟲量應(yīng)大于本實驗的檢測值。本研究的特色與創(chuàng)新點是:在蜘蛛領(lǐng)域中首次應(yīng)用DNA條形碼、二代測序和數(shù)字PCR技術(shù)等前沿分子生物學(xué)手段,從微觀角度成功列出了不同生境下擬環(huán)紋豹蛛的食譜清單,并建立了其在自然狀態(tài)下控蟲效能的評估方法及其數(shù)學(xué)模型,對傳統(tǒng)方法無法全方位檢測蜘蛛食譜和精準捕食量的難題進行了探討。本文研究結(jié)果揭示了擬環(huán)紋豹蛛在生物控蟲中的重要作用,有利于了解生物種群在進化過程中,蜘蛛與其獵物間的演化關(guān)系,理論上豐富了蜘蛛學(xué)內(nèi)涵;生產(chǎn)實踐上,該研究為在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中制定IPM策略提供了新的實用數(shù)據(jù);為保蛛控蟲提供新的理論依據(jù)和科學(xué)信息,對減少農(nóng)藥用量,保護生態(tài)環(huán)境與人類健康有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476.2
【圖文】：

圖1-1 IPM關(guān)鍵要素的金字塔圖Fig 1-1 IPM pyramid showing the most important pest management elements從圖1-1[25]中可以看出，IPM金字塔的基礎(chǔ)層由非生物元素組成，可以在種植之前或之后施用，并可以持續(xù)到收獲期。金字塔的中間層可歸類為生態(tài)元素，其中包含的五個重要元素遵循一個循環(huán)體系，并形成了基于生態(tài)學(xué)的IPM研究基礎(chǔ)，其中箭頭表示生態(tài)元素之間特殊的相互作用。最后，金字塔的頂層為化學(xué)殺蟲劑，當更多的基礎(chǔ)性IPM手段不能將害蟲種群控制在閾值以下時，才有必要應(yīng)用化學(xué)殺蟲手段。作為IPM的核心環(huán)節(jié)[25, 26]

圖1-3 2000年至2018年間狼蛛相關(guān)的論文引用量Fig 1-3 The citations of papers related to Lycosidae research between 2000 and 2018圖1-4統(tǒng)計了2000年至2018年間發(fā)表的狼蛛相關(guān)論文的研究方向（來源于WebofScience數(shù)據(jù)庫）。數(shù)據(jù)顯示，自二十一世紀以來，狼蛛在動物學(xué)、昆蟲學(xué)、生態(tài)學(xué)、行為學(xué)和生化及分子生物學(xué)這五大領(lǐng)域的研究備受關(guān)注，分別占研究總量的26.48%、17.83%、16.46%、12.57%和10.26%。Zoology26.48%Entomology17.83%Ecology16.46%

基于分子生物技術(shù)的狼蛛攝食分析及控蟲效能評價27圖3-1 黑腹果蠅基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物Fig 3-1 PCR results of Drosophila melanogaster’s DNAM: DNA Marker DS2000; A1~4: 擬環(huán)紋豹蛛進食1~4頭果蠅后的PCR產(chǎn)物M: DNA Marker DS2000; A1~4: PCR product of feeding 1~4 Drosophilamelanogaster1.3.2PCR 擴增及其對果蠅消化速率測定根據(jù)表3-1設(shè)定的PCR反應(yīng)體系，以黑腹果蠅的基因序列為目標片段設(shè)計引物，對進食黑腹果蠅后不同時間點的擬環(huán)紋豹蛛組織勻漿液進行PCR擴增，電泳結(jié)果如圖3-2所示：陽性對照有明顯擴增條帶，大小約為500bp，且無雜帶；而陰性對照未擴增出特異性產(chǎn)物，證明PCR實驗體系成立。且檢測出不同消化時間點的擬環(huán)紋豹蛛電泳結(jié)果大部分呈陽性，根據(jù)Marker條帶指示，擴增產(chǎn)物片段的大小均為500 bp左右

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9 吳六O

本文編號：2752825