【摘要】：西花薊馬Frankliniella occidentalis(Pergande)是一種重要的入侵害蟲(chóng),自2003年入侵我國(guó)以來(lái),已在北京、云南、山東、新疆、浙江、貴州、江蘇、吉林、寧夏、西藏等多個(gè)地區(qū)廣泛分布,成為我國(guó)園藝作物上最具威脅的害蟲(chóng)之一。由于殺蟲(chóng)劑的大量使用,加之西花薊馬具有世代周期短、繁殖力強(qiáng)及孤雌生殖等特點(diǎn),導(dǎo)致西花薊馬的抗藥性發(fā)展迅速,急需制訂有效的抗性治理策略�？顾幮员O(jiān)測(cè)和抗藥性機(jī)理研究是抗性治理的基礎(chǔ)和依據(jù),本研究對(duì)西花薊馬田間種群進(jìn)行了抗藥性監(jiān)測(cè);調(diào)查了拉薩地區(qū)西花薊馬的發(fā)生規(guī)律并建立了種群生命表;以多殺菌素敏感(Ivf03)和抗性(NIL-R)近等基因系西花薊馬種群為研究材料,對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的差異表達(dá)基因——內(nèi)表皮糖蛋白基因(endocuticle structural glycoprotein,縮寫(xiě)為SgAbd-1-like)進(jìn)行了克隆和定量分析;建立了西花薊馬的RNA干擾體系,為后續(xù)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果:1.西花薊馬田間種群對(duì)不同藥劑的抗性監(jiān)測(cè)從云南嵩明、元謀和上蒜、北京昌平、順義和海淀、遼寧臺(tái)安地區(qū)采集田間西花薊馬種群,測(cè)定了其對(duì)乙基多殺菌素、多殺菌素、高效氯氰菊酯、溴蟲(chóng)腈、阿維菌素、噻蟲(chóng)嗪和甲維鹽的抗藥性水平。結(jié)果表明,上述7個(gè)地區(qū)的西花薊馬均對(duì)多殺菌素類(lèi)藥劑產(chǎn)生了抗藥性,其中北京昌平、順義和遼寧臺(tái)安地區(qū)的抗性水平高達(dá)近十萬(wàn)倍,建議停止使用。各地區(qū)種群對(duì)阿維菌素、噻蟲(chóng)嗪、高效氯氰菊酯較為敏感,推薦使用。遼寧臺(tái)安和北京海淀地區(qū)種群分別對(duì)溴蟲(chóng)腈和甲維鹽產(chǎn)生中等水平抗性,建議在這兩個(gè)地區(qū)減少使用這兩種藥劑。2.西藏拉薩西花薊馬田間種群生命表及發(fā)生規(guī)律調(diào)查通過(guò)建立西藏拉薩地區(qū)西花薊馬種群的兩性生命表,并采用黃板誘集成蟲(chóng)的方法調(diào)查了日光溫室番茄上西花薊馬的周年發(fā)生動(dòng)態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該種群西花薊馬成蟲(chóng)前期總發(fā)育歷期為12.54 d,2齡若蟲(chóng)發(fā)育歷期為5.62 d,占成蟲(chóng)前期發(fā)育歷期的44.8%,卵能存活到成蟲(chóng)階段的概率為0.598。雌蟲(chóng)的平均壽命為15.18 d,雄蟲(chóng)為9.64 d。該種群的內(nèi)稟增長(zhǎng)率(r)和凈增殖率(R_0)分別為0.153/d和22.817。在拉薩日光溫室番茄上能夠周年發(fā)生,種群增長(zhǎng)呈“單峰”型,6月中旬至8月上旬為發(fā)生盛期。3.SgAbd-1-like基因克隆及定量分析西花薊馬SgAbd-1-like基因全長(zhǎng)為1016 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?23 bp,5’UTR和3’UTR分別為89 bp,207 bp,編碼240個(gè)氨基酸,無(wú)信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)(pI)為5.95,為偏酸性蛋白,分子量(Mw)為26.681 KDa,且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。與大部分其他物種的SgAbd-1-like基因一樣,西花薊馬的SgAbd-1-like基因含有1個(gè)保守區(qū)域:幾丁質(zhì)結(jié)合域(chitin binding domain 4,Cht BD4)(148-202),屬于CPR家族RR-1亞類(lèi)。熒光定量分析發(fā)現(xiàn),與Ivf03種群相比,該基因在NIL-R種群中的表達(dá)量呈上升趨勢(shì),但無(wú)顯著差異;同一種群不同齡期的表達(dá)量差異顯著,在一齡若蟲(chóng)期表達(dá)量最低,并隨著齡期的發(fā)育,表達(dá)量不斷升高且在成蟲(chóng)期的表達(dá)量達(dá)到最高。4.西花薊馬RNA干擾體系的建立將體外合成的dsRNA與10%花粉溶液混合,通過(guò)飼喂的方法將dsRNA導(dǎo)入到西花薊馬體內(nèi),并采用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)不同干擾時(shí)間后西花薊馬體內(nèi)目的基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明西花薊馬取食含dsEGFP或僅為花粉溶液(CK)的飼喂液后在不同時(shí)間段內(nèi)目的基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著,但在12 h-24 h內(nèi)取食含目的基因ds-RNA的飼喂液后目的基因基因的表達(dá)量顯著下降,并在干擾24h后目的基因的表達(dá)量達(dá)到最低,干擾效率可以達(dá)到60%以上。
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;S433.89
【圖文】：

圖 4-1 SgAbd-1-lik 序列分析Figure 4-1Analysis of SgAbd-1-like protein sequence：SgAbd-1-like 的序列分析 Sequence analysis of SgAbd-1-like；方框內(nèi)為幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域blackbox : chitin binding domain 4, Cht BD4。B：Weblogo 分析 SgAbd-1-like sequence 保守基Analysis of conserved motifs by Weblogo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi).3.2 Ivf03 和 NIL 種群 SgAbd-1-lik 基因的序列比較03-103-203-3-1-2-3sensus gGGGGGGaAAAAAAtTTTTTTcCCCCCCgGGGGGGtTTTTTTtTTTTTTcCCCCCCtTTTTTTgGGGGGGtTTTTTTgGGGGGGtTTTTTTgGGGGGGtTTTTTTgGGGGGGcCCCCCCtTTTTTTcCCCCCCgGGGGGGcCCCCCCgGGGGGGgGGGGGGtTTTTTTgGGGGGGgGGGGGGcCCCCCCgGGGGGGCGGGGGcCCCCCCcCCCCCCgGGGGGGtTTTTTTcCCCCCCgGGGGGGcCCCCCCcCCCCCCCCCCGCgGGGGGGcCCCCCCGCCCCCcCCCCCCCCCCCGGGCCCGaAAAAAAcCCCCCCtTTTTTTaAAAAAAcCCCCCCcCCCCCCaAAAAAAcC

5.2 實(shí)驗(yàn)方法.2.1 目的基因 RNAi 干擾引物的設(shè)計(jì)及 dsRN目的基因 RNAi 干擾引物的設(shè)計(jì)：以目的基因編碼的 siRNA 結(jié)合位點(diǎn)網(wǎng)站 http://www.flyrnai.org/cgi-bi花薊馬目的基因 RNAi 干擾引物設(shè)計(jì)，選擇產(chǎn)物長(zhǎng)退火溫度均在 57°C 左右，篩選出 PairPenalty 較低的上下游引物的 5’端添加 T7 啟動(dòng)子序列-TAATACGA為 ds-1。RNA 干擾引物為：基因名稱(chēng)Gene name引物序列The sequence of圖 5-1 西花薊馬 RNAi 裝置示意圖Figure.5-1 Schematic diagram of RNAinterference dev

【參考文獻(xiàn)】

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