【摘要】：蘋果輪紋病是世界上最嚴(yán)重的蘋果病害之一,它主要是由Botryosphaeria dothidea(B.dothidea)引起的。蘋果是我國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)作物,在蘋果的生產(chǎn)過(guò)程中,蘋果輪紋病能夠造成蘋果果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的顯著下降,導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,研究蘋果對(duì)輪紋病的抗性機(jī)制對(duì)于提高蘋果果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。前人研究表明,泛素化途徑在多種生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。泛素化是由泛素激活酶E1,泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3通過(guò)一系列的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)完成的。其中,E3泛素連接酶決定了靶蛋白的特異性,從而促進(jìn)了下游靶蛋白的泛素化。本研究中,我們報(bào)道了一個(gè)蘋果BTB-BACK結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶蛋白POZ/BTB CONTAINING-PROTEIN 1(MdPOB1),通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法研究了它在蘋果對(duì)病原菌B.dothidea的防御方面發(fā)揮的作用。并通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究了MdPOB1蛋白在蘋果輪紋病抗性機(jī)制中發(fā)揮作用的分子機(jī)理。主要研究工作和結(jié)果如下:1.MdPOB1抑制蘋果對(duì)B.dothidea的防御能力生物信息學(xué)分析顯示,MdPOB1(基因序列號(hào):MD07G1143200)含有一個(gè)保守的BTB-BACK結(jié)構(gòu)域,并且與AtPOB1具有較高的同源性。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了MdPOB1過(guò)量表達(dá)(MdPOB1-OVX)和抑制表達(dá)(MdPOB1-ANTI)的蘋果愈傷組織,并通過(guò)瞬時(shí)注射的方法獲得了過(guò)量表達(dá)(MdPOB1-IL60)和抑制表達(dá)(MdPOB1-TRV)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化蘋果果實(shí)。接種B.dothidea后發(fā)現(xiàn),過(guò)量表達(dá)的蘋果愈傷組織和蘋果果實(shí)均降低了對(duì)它的防御能力,而抑制表達(dá)的蘋果愈傷組織和蘋果果實(shí)均提高了對(duì)它的防御能力。說(shuō)明MdPOB1能夠抑制蘋果對(duì)B.dothidea的防御能力。2.MdPOB1蛋白與MdPUB29蛋白互作并能夠?qū)⑵浞核鼗到鉃榱颂骄縈dPOB1抑制蘋果對(duì)B.dothidea防御能力的分子機(jī)制,首先利用酵母雙雜交的方法篩選到了一個(gè)蘋果U-box結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶MdPUB29與MdPOB1蛋白互作,并通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了MdPOB1蛋白與MdPUB29蛋白之間的互作。體外蛋白降解實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)表明MdPOB1蛋白能夠通過(guò)泛素/26S蛋白酶體途徑促進(jìn)MdPUB29蛋白的降解。3.MdPUB29增強(qiáng)蘋果對(duì)B.dothidea的防御能力生物信息學(xué)分析顯示,MdPUB29(基因序列號(hào):MD01G1010900)含有一個(gè)保守的U-box結(jié)構(gòu)域,并且與AtPUB29親緣關(guān)系最近,同源性最高。亞細(xì)胞定位顯示MdPUB29定位于細(xì)胞核中。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了MdPUB29過(guò)量表達(dá)(MdPUB29-OVX)和抑制表達(dá)(MdPUB29-ANTI)的蘋果愈傷組織,以及異位表達(dá)MdPUB29的擬南芥植株。接種B.dothidea后發(fā)現(xiàn),過(guò)量表達(dá)的蘋果愈傷組織和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株均提高了對(duì)B.dothidea的防御能力,而抑制表達(dá)的蘋果愈傷組織則降低了對(duì)B.dothidea的防御能力。說(shuō)明MdPUB29能夠增強(qiáng)蘋果對(duì)B.dothidea的防御能力。4.MdPOB1以依賴于MdPUB29的方式抑制蘋果對(duì)B.dothidea的防御能力為了進(jìn)一步研究MdPOB1抑制蘋果對(duì)B.dothidea防御能力的機(jī)制,通過(guò)瞬時(shí)注射的方法獲得了MdPOB1抑制表達(dá)(MdPOB1-TRV),MdPUB29抑制表達(dá)(MdPUB29-TRV)以及MdPOB1和MdPUB29共同抑制表達(dá)(MdPOB1-TRV+MdPUB29-TRV)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化蘋果果實(shí)。接種B.dothidea后發(fā)現(xiàn),單獨(dú)抑制MdPOB1表達(dá)的蘋果果實(shí)提高了對(duì)它的防御能力,而單獨(dú)抑制MdPUB29表達(dá)以及共同抑制MdPOB1和MdPUB29表達(dá)的蘋果果實(shí)均降低了對(duì)它的防御能力。說(shuō)明MdPOB1以依賴于MdPUB29的方式抑制蘋果對(duì)B.dothidea的防御能力。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.44
【圖文】：

導(dǎo)底物特異性，在泛素化酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用（BerndsenandWolberger,2014; Furniss et al., 2018）。泛素化降解蛋白質(zhì)需要通過(guò)泛素化蛋白酶體途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，蛋白酶體存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，是一種由十到二十個(gè)亞基組成的蛋白復(fù)合物（金曉琴等,2014; 劉詩(shī)o鄣

本文編號(hào)：2733564