【摘要】：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是典型的死體營養(yǎng)型植物病原真菌,寄主范圍極其廣泛,能夠侵染1400多種植物,其引起的灰霉病對全球范圍的農業(yè)生產造成嚴重危害,帶來巨大的經濟損失。近年來,隨著全基因組序列的公開,灰葡萄孢菌致病的分子機理得到了廣泛研究,使得人們對灰葡萄孢菌與寄主互作過程的認識不斷更新。盡管已鑒定出多個致病相關基因,但該菌的致病調控機制尚未被充分發(fā)掘。構建突變體庫是挖掘新基因及進行功能基因組學研究的有效途徑,本研究利用農桿菌介導的遺傳轉化體系(ATMT),構建了一個約含9000個轉化子的灰葡萄孢菌T-DNA插入轉化子群體,采用番茄和草莓兩種不同的寄主葉片進行致病性篩選,經三輪復篩從中獲得400多個致病力喪失或下降的突變體。通過熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)進行側翼序列的克隆及分析確定T-DNA的整合部位,從T-DNA標記的基因中選取了三個候選基因進行后續(xù)研究,并分別命名為BcNOP53、BcRAB-6A及BcSNF2。為研究候選基因的生物學功能及作用機理,我們對其進行了定向敲除及遺傳互補,通過檢測基因敲除突變體ΔBcnop53、ΔBcrab-6a及ΔBcsnf2的致病力,進一步確認了候選基因BcNOP53和BcSNF2與T-DNA插入突變體致病表型的相關性,并對其在調控病原物發(fā)育和致病過程中的生物學功能和機制展開了系統(tǒng)的研究。核糖體是細胞內負責蛋白質生物合成的重要細胞器,然而目前對于核糖體如何調節(jié)微生物的致病過程知之甚少。本研究結果表明,BcNop53具有與酵母Nop53p類似的功能,是核糖體60S亞基成熟后期的作用因子,對病原菌的生長、致病發(fā)育及致病力至關重要。BcNop53定位于細胞核內,該蛋白在酵母突變體ΔScnop53中表達能夠完全恢復后者生長緩慢的缺陷;同樣,BcNOP53基因缺失導致灰葡萄孢菌生長速率減慢。研究還發(fā)現(xiàn),BcNOP53基因缺失導致灰葡萄孢菌致病力喪失且侵染結構形成受阻與病原物中活性氧(ROS)產生減少有關。此外,BcNop53缺失降低了灰葡萄孢菌分生孢子產量及對逆境脅迫的適應,改變了分生孢子及菌核形態(tài),延緩分生孢子與菌核的萌發(fā),并降低了細胞壁降解酶的活性;然而,ΔBcnop53菌核數量顯著增加。將完整的BcNOP53基因導入ΔBcnop53能夠完全恢復上述表型缺陷。Snf2家族是一類依賴ATP的解旋酶類似(helicase-like)蛋白,能夠通過水解ATP獲得能量來改變染色質的結構,從而改變組蛋白與DNA之間的接觸,以便完成DNA復制、轉錄、重組或修復等生物學過程。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),BcSnf2是該家族中的一員,其在病原真菌中的生物學功能尚未見報道,本研究發(fā)現(xiàn),BcSnf2在灰葡萄孢菌發(fā)育及致病過程中具有重要的作用,可調節(jié)某些特定基因的轉錄水平,推測Bc Snf2可能通過調控某些致病因子的轉錄水平參與灰葡萄孢菌的致病過程。BcSNF2基因缺失導致灰葡萄孢菌致病力顯著減弱,同時導致灰葡萄孢菌生長速率下降、產孢量降低、孢子萌發(fā)遲緩、菌落與菌核的形態(tài)發(fā)生改變。利用轉錄組測序(RNA-seq)技術對ΔBcsnf2與野生型B05.10基因差異表達水平進行了分析,在差異表達基因中,除與生長發(fā)育相關的基因外,還富集到一些參與致病過程的基因,其中包括已經報導的灰葡萄孢菌致病因子,我們將在后續(xù)的研究中對BcSnf2及Snf2家族其他成員調控灰葡萄孢菌自身發(fā)育及其與寄主互作過程的機制進行系統(tǒng)的分析。簡言之,本研究以灰葡萄孢菌為材料,構建T-DNA插入突變體庫,從中鑒定出BcNOP53和BcSNF2兩個新穎的致病相關基因并對其進行系統(tǒng)的生物學功能分析,闡釋了灰葡萄孢菌生長、致病發(fā)育和侵入寄主等有賴于BcNop53調控相關蛋白合成及內源活性氧ROS產生的機制;同時解析了Snf2家族成員BcSnf2調控基因轉錄,影響病原菌生長發(fā)育及致病的生物學功能。本研究為核糖體發(fā)生及依賴ATP的染色質重塑復合物介導的表觀遺傳調控調節(jié)真菌致病過程的機制提供了新的見解,可能為解決真菌疾病開辟新的靶點,為作物灰霉病綠色防控提供理論依據。
【圖文】：

灰葡萄孢菌的侵染循環(huán)(Amselemetal.,2011)

Fig.2.8 The feature map of the gene BC1G_02571 in Botrytis cinerea5）轉化子 M7280該轉化子致病力喪失，接種草莓及番茄葉片后，無可見病斑出現(xiàn)。TAIL-PCR 獲得 259 bp T-DNA 片段，T-DNA 插入基因 BC1G_08709 與BC1G_08710 之間，該插入位點距離 BC1G_08709 起始密碼子 90 bp，距離BC1G_08710 起始密碼子 201 bp （圖 2.9）。 BC1G_08709 基因由 1366 個核苷酸組成，包含 2 個外顯子（圖 2.10），，編碼 437 個氨基酸的未知蛋白，包含一個 NOP53結構域；灰葡萄孢菌基因組數據庫序列信息顯示，BC1G_08710 基因序列全長為888 bp, 包含 3 個外顯子，編碼 207 個氨基酸的假定 GTP-binding 蛋白，包含結構域 Rab6 和 Ras，NCBI 最新數據顯示 BC1G_08710 基因序列全長為 564 bp（圖2.11），本研究中 BC1G_08710 基因序列參考灰葡萄孢菌基因組數據庫中的序列信息。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S432.44

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