發(fā)布時(shí)間：2020-04-21 19:39

【摘要】：植物細(xì)菌性青枯病(bacterial wilt of plants)是由雷爾氏菌屬植物致病種(Ralstonia spp.泛稱青枯菌)引起的一種世界性分布的重大土傳病害。作為防治青枯病等細(xì)菌性病害的重要?dú)⒕鷦?銅制劑的廣泛使用造成多種植物病原細(xì)菌群體中出現(xiàn)了銅抗性菌株。全基因組序列測(cè)定表明,青枯菌Po82菌株大質(zhì)粒上普遍攜帶了丁香假單胞菌中的銅抗性編碼基因copSRABCD的同源物。以青枯菌Po82菌株為研究對(duì)象,通過反向遺傳學(xué)的研究手段,構(gòu)建copA、copD、copSR基因缺失菌株及相應(yīng)互補(bǔ)菌株。解析了copA、copD、copSR基因與青枯菌銅脅迫應(yīng)答、代謝活性、致病力和運(yùn)動(dòng)性等表型生物學(xué)特征之間的關(guān)系以及copSRABCD基因簇的表達(dá)調(diào)控關(guān)系。應(yīng)用RNA-seq測(cè)序技術(shù),測(cè)定Po82菌株以及copABCD基因缺失菌株在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)條件、銅誘導(dǎo)培養(yǎng)以及寄主體內(nèi)環(huán)境的轉(zhuǎn)錄本,發(fā)掘不同培養(yǎng)條件下共表達(dá)與差異表達(dá)的基因,以期探明copSRABCD基因簇的功能并發(fā)掘新的銅抗性及致病相關(guān)基因,為進(jìn)一步深入解析青枯菌寄主及環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。1.銅抗性候選基因copA、copD、copSR基因功能驗(yàn)證銅MIC測(cè)定結(jié)果表明Po82△copA、Po82△copD及Po82△copSR菌株的銅抗性MIC值都較野生型菌株降低。致病力測(cè)定結(jié)果表明,相較于野生型菌株,Po82△copA菌株的致病力下降,Po82△copSR菌株的致病力增強(qiáng),而Po82△copD菌株的致病力沒有顯著差異。生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明,在銅脅迫的環(huán)境中,copA、copD缺失菌株影響青枯菌的生長(zhǎng)速率。運(yùn)動(dòng)性測(cè)定結(jié)果表明,copA基因與青枯菌的運(yùn)動(dòng)能力無關(guān),copD、copSR基因的缺失影響青枯菌的運(yùn)動(dòng)能力。并且copA的缺失導(dǎo)致青枯菌對(duì)α-D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源,L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代謝利用速率降低。2.銅抗性基因簇表達(dá)調(diào)控測(cè)定qRT-PCR結(jié)果顯示copSRABCD基因簇的表達(dá)受到銅離子的誘導(dǎo),copABCD基因的表達(dá)量隨著CuSO_4濃度的增加而增加,證實(shí)了該基因簇為誘導(dǎo)型表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示,copABCD為同一轉(zhuǎn)錄單位,copSR為同一轉(zhuǎn)錄單位。通過測(cè)定copSR基因缺失菌株中copABCD基因的表達(dá)模式,明確了copSR對(duì)copABCD基因的調(diào)控方式為負(fù)調(diào)控。3.青枯菌離體與體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究研究明確了離體培養(yǎng)條件下,亞抑制銅濃度水平誘導(dǎo)不僅可正調(diào)控Po82和Po82△copABCD菌株銅抗性相關(guān)基因的表達(dá),相當(dāng)數(shù)量的致病相關(guān)基因的表達(dá)也顯著上調(diào)。上調(diào)表達(dá)的致病相關(guān)基因大部分為hrp基因簇的組成基因和III型效應(yīng)子(T3Es)編碼基因。此外,離體銅誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,Po82和Po82△copABCD菌株中的czcABC、fur、marR等重金屬和抗生素調(diào)控基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。在寄主體內(nèi)環(huán)境中,copABCD基因簇缺失菌株上調(diào)表達(dá)Ⅳ型菌毛編碼基因及致病相關(guān)基因。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為進(jìn)一步明確copSRABCD基因簇的功能并發(fā)掘新的銅抗性及致病相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

Safni 等（Safni et al., 2014）根據(jù) 16S-23S rRNA ITS 基因序列、部Biolog 代謝分析等分析，將青枯菌復(fù)合種劃分為 3 個(gè)基因型群： solanacearum）只包含演化型 II 的菌株，保持原系統(tǒng)分類框架，桃雷爾氏菌（Ralstonia syzygii）包含演化型 IV 的菌株，在種內(nèi)又gii subsp. syzygii）、蒲桃亞種（R. syzygii subsp. indonesiensis）和西elebesensis） 3 個(gè)亞種；（3）假茄科雷爾氏菌（Ralstonia pseud類框架中的演化型 I 和 III 的菌株。Prior 等根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析A-DNA 雜交分析，進(jìn)一步支持了青枯菌新系統(tǒng)的劃分（Prior et 該分類系統(tǒng)還未廣泛采用，故本論文依然沿用青枯菌傳統(tǒng)的分類癥狀及青枯菌侵染循環(huán)主植物的整個(gè)生育期均可造成危害，發(fā)病的適宜溫度為 30~36℃作傷根、地下害蟲、管理粗放等都會(huì)提高青枯病的發(fā)病率，為青。植物受青枯菌侵染以后，最初植株未出現(xiàn)異常，一段時(shí)間以后并保持葉片青綠色，呈青枯癥狀。該病可以發(fā)生在寄主生長(zhǎng)時(shí)期乳白色或淡黃色菌液排出。

院碩士學(xué)位論文 （T3Es）“注射”至宿主細(xì)胞，，與宿主細(xì)胞產(chǎn)生一系列反應(yīng)。Genin 等研 70~80 個(gè) T3Es（Genin and Boucher, 2004; Daniela and Bonas, 2014），青變體表現(xiàn)為完全喪失的致病力，說明 T3Es 在青枯菌致病過程中發(fā)揮重要明 T3SS 只在侵染初期有活力，隨著病菌進(jìn)入宿主維管束和細(xì)胞密度增加但近期 Jacobs 等通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和反轉(zhuǎn)錄熒光定量 PCR 的方法測(cè)定了轉(zhuǎn)錄活性，表明 T3SS 在整個(gè)治病過程中都具有生物學(xué)作用（Jacobs et
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.42

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5 張麗R

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