【摘要】：當今世界,科技發(fā)展日新月異,科技的進步帶動現(xiàn)代生物技術的大發(fā)展,其中轉基因技術又被稱之為人類歷史上具有飛躍性進步的第二次“綠色革命”。轉基因技術就是在作物原有基因的基礎上引入外源基因,改造其遺傳物質,使其營養(yǎng)價值、生物性狀更好的滿足人類的需要。利用轉基因技術把蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)轉入到小麥體內,目的主要是增加小麥的抗蟲性,其中蘇云金芽孢桿菌的δ-內毒素基因是小麥獲得抗蟲性能的最主要原因。但是轉基因技術也存在一定的生物安全性問題,所以世界各國不斷加強對轉基因作物的監(jiān)管力度與檢測手段的研發(fā)。本論文應用標記熒光猝滅基團(BHQ-1)的單鏈DNA(triplex-forming oligonucleotides TFO)和兩端同時標記熒光基團(FAM-6)的單鏈DNA(Single DNA S-DNA)構建三螺旋DNA分子信標,然后目標DNA單鏈(Target DNA T-DNA)和三螺旋DNA分子信標接觸,導致三螺旋結構發(fā)生改變,從而引起熒光信號強度的改變,實現(xiàn)對轉基因作物的靈敏檢測。主要內容如下所示:弱酸性環(huán)境下自組裝三螺旋分子信標用于轉基因作物中的目標基因蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)靈敏檢測;最近幾年,三螺旋分子信標被廣泛用于轉基因作物的靈敏檢測,其中包括T·A?T和C~+·G?C(?是Watson-Crick氫鍵,·是Hoogsteen氫鍵)等三螺旋結構在內的分子信標是最為常用的。當三螺旋分子信標形成時,含有嘧啶鏈(胸腺嘧啶T和胞嘧啶C的)的單鏈DNA(triplex-forming oligonucleotides,TFO)需要在弱酸性環(huán)境下首先質子化后才能和雙鏈DNA的嘌呤鏈(A和G)結合形成穩(wěn)定的三螺旋分子信標,其中含有胞嘧啶C的DNA單鏈(TFO)質子化后,帶正電的胞嘧啶C~+與帶負電的DNA雙鏈由于靜電作用,能夠起到穩(wěn)定三螺旋分子信標的作用。目標DNA單鏈加入后可以破壞三螺旋信標的結構,導致熒光強度的改變,實現(xiàn)對轉基因作物的靈敏檢測,檢測下限達到1 pM。中性環(huán)境下自組裝三螺旋分子信標用于轉基因作物目標基因蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis Bt)靈敏檢測;為了擴展三螺旋分子信標的應用范圍,在本論文中人為加入Ag~+用來增加三螺旋分子信標在中性環(huán)境下的穩(wěn)定性。Ag~+不僅能夠特異性識別C·G?C的三螺旋結構,而且還可以把C~+·G?C中的H~+置換成Ag~+C·G?C新的三螺旋結構,這樣Ag~+的加入就極大的增加三螺旋分子信標的應用范圍。目標DNA單鏈加入后可以破壞三螺旋信標的結構,導致熒光強度的改變,實現(xiàn)對轉基因作物的靈敏檢測,檢測下限達到0.1 pM。
【圖文】：

1100 萬 hm2(王宇，2014)。自轉基因技術發(fā)展到今天，美國是世界上最早技術，也是商品化種植最多的國家。截止到 2015 年時，美國約 94%的棉花豆、92%的玉米均是轉基因作物。轉基因作物的種植也為美國農業(yè)帶來了巨2017 年，我國的轉基因植物種植面積為達到 370 萬 hm2，主要是以木瓜、為主，但小麥、玉米、水稻、大豆等主要糧食作物未種植轉基因品種(Zhan)。從 20 世紀 80 年代中期的“十五”開始，我國就重點開展功能基因克隆心技術創(chuàng)新、新產品培育與產業(yè)化、轉基因新材料創(chuàng)新和轉基因作物安全性的研究(汪其懷，2017)，充分利用我國現(xiàn)有的資源和人才追趕世界發(fā)展腳步大突破和科技創(chuàng)新成果。目前，我國雖然實現(xiàn)主糧的基本自給，但農產品缺口的大多數(shù)糧食作物均為轉基因作物，我國逐步成為轉基因糧食產品的消濤，2017)。

云金芽孢桿菌最早是 Ishiwata 在蠶蛾中發(fā)現(xiàn)的，后來又因在德國蘇云金省重命名。直到二十世紀五十年代人們才發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性是由該變成孢芽時產生的晶體蛋白造成的，因為這些晶體蛋白具有一定的殺蟲效果為殺蟲蛋白或者是蘇云金桿毒蛋白。蘇云金芽孢桿菌轉基因草地植株對多種抗性，而且食用該植株的棉鈴蟲幼蟲的死亡率高達 80%。轉蘇云金桿毒蛋白列 Cry1A 基因的棉花，不僅對鱗翅目類害蟲有高抗性，而且還同時對雙翅目具有抗性(Toshiyuki et al，，2011)。我國在 1991 年就研制出了轉 Bt 基因的甘藍花等，其中我國第一代轉 Bt 基因的抗蟲棉花的抗蟲性達到了 95%以上%-80%的農藥用量，產量增加了 40%-50%。到現(xiàn)在為止，全球共有 60 多種轉植物，其中大多數(shù)應用的蘇云金桿毒蛋白氨基酸序列是 Cry1，也有少部分是在我國研制成功的轉 Bt 基因植物主要有馬鈴薯、水稻、番茄、玉米、大豆麥等。其中玉米和棉花已經進入大規(guī)模商業(yè)化推廣階段(張寶紅，2000）。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;S188

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本文編號：2609185