【摘要】：土壤鹽漬化是制約沿海防護(hù)林建設(shè)的重要因素之一。提高林木生產(chǎn)力和適逆性(特別是耐鹽能力)是進(jìn)一步發(fā)揮林業(yè)生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益的重要舉措。利用傳統(tǒng)育種、細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)提高植株耐鹽堿能力已取得一系列重要進(jìn)展,然而,林木耐鹽性是由多個(gè)數(shù)量性狀基因控制的復(fù)雜性狀,且育種周期長(zhǎng)。因此在林木耐鹽常規(guī)和分子育種研究中仍遇到了很大挑戰(zhàn)。根際共生菌對(duì)提高農(nóng)林植物生產(chǎn)力和適應(yīng)性至關(guān)重要。根系非菌根真菌(non-mycorrhizal fungi,包括根際真菌和內(nèi)生真菌)就是一類普遍存在的能夠?qū)χ参锉硇秃蜕懋a(chǎn)生重要調(diào)控作用的微生物。但是,目前對(duì)非菌根真菌(特別在極端環(huán)境中)協(xié)同林木生長(zhǎng)及耐鹽的潛力與機(jī)制的認(rèn)識(shí)還十分有限。本論文在構(gòu)建豐富的林木非菌根真菌資源庫(kù)基礎(chǔ)上,以楊樹(shù)和楓香等重要沿海防護(hù)林樹(shù)種為研究對(duì)象,旨在研究非菌根真菌對(duì)苗木生長(zhǎng)和耐性能力的調(diào)控效應(yīng)并初步闡明可能的作用機(jī)制,最后對(duì)林木根部菌劑接種方法進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果為創(chuàng)制新型植物促生、抗逆型接種劑奠定理論基礎(chǔ),為今后成果轉(zhuǎn)化和應(yīng)用提供新的技術(shù)依據(jù)。本研究對(duì)浙江富陽(yáng)、江蘇泗洪和河北威縣良種基地的楊樹(shù)以及多種灘涂鹽生植物的根系非菌根真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。同時(shí),依托于國(guó)內(nèi)外合作基礎(chǔ),搜集了多種根系內(nèi)生真菌資源。因此初步構(gòu)建了多生境、多宿主來(lái)源的根系非菌根真菌資源庫(kù)。以重要沿海防護(hù)林樹(shù)種毛白楊(Populus tomentosa)和美洲黑楊雜種優(yōu)良無(wú)性系NL-895楊(P.×euramericana cv.‘Nanlin895’,NL895)無(wú)性系無(wú)菌苗及北美楓香(Liquidambar styraciflua)的實(shí)生苗為研究對(duì)象,將供試菌株接種到上述苗木根系中,通過(guò)添加海鹽溶液篩選具有促生和耐鹽效應(yīng)的菌株。主要研究結(jié)果如下:(1)供試菌株基礎(chǔ)生物學(xué)特性及功能初篩:選用45株真菌菌株,包括33株子囊菌(Ascomycota),4株擔(dān)子菌(Basidiomycota)與8株低等菌。主要類群有鐮刀菌屬(Fusarium)、格孢腔目(Pleosporales)、柔膜菌目(Helotiales)和被孢霉屬(Mortierella)等真菌。建立上述菌株與毛白楊和NL-895楊無(wú)性系無(wú)菌苗的共生體系,通過(guò)觀察楊樹(shù)幼苗接種后的表型變化(主要包括株高、根長(zhǎng)和鮮重等指標(biāo))及根部細(xì)胞是否有侵染結(jié)構(gòu)形成,初步篩選具有潛在促生效應(yīng)的功能菌株。(2)內(nèi)生彎孢霉菌株對(duì)毛白楊的促生、耐鹽效應(yīng):源自鹽生植物鹽地堿蓬(Suaeda salsa)健康植株根系的內(nèi)生彎孢霉(Curvularia sp.)菌株R2015-25可與毛白楊(P.tomentosa)順利建立共生體系并表現(xiàn)出顯著的促生效應(yīng)。顯微觀察表明接種14 d后,R2015-25的菌絲可順利侵染定殖在毛白楊的根部并形成類似微菌核的侵染結(jié)構(gòu),在皮層細(xì)胞和根毛中可見(jiàn)念珠狀菌絲。說(shuō)明該菌株可能屬于暗色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophyte,DSE)。盆栽試驗(yàn)中,施加海鹽脅迫后,處理組楊樹(shù)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)顯著高于對(duì)照組;葉綠素a、葉綠素b和脯氨酸(proline,Pro)含量也有所上升。處理組楊樹(shù)葉片光反應(yīng)系統(tǒng)Ⅱ(photosystem II,PSⅡ)的電子傳遞效率(electron transport rate,ETR)、PSII實(shí)際光合效率Φ_(PSⅡ)及光化學(xué)淬滅值q P均顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,菌株R2015-25接種到毛白楊上可緩解宿主楊樹(shù)所受的鹽脅迫,這為極端環(huán)境內(nèi)生真菌資源提高林木耐鹽能力的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。(3)3株內(nèi)生鐮刀菌對(duì)北美楓香的促生、耐鹽效應(yīng):探討3株源于灘涂鹽堿地植物濱麥(Leymus mollis)的內(nèi)生鐮刀菌(Fusarium spp.)對(duì)北美楓香幼苗生長(zhǎng)和耐鹽性的調(diào)控效應(yīng)。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)方法鑒定內(nèi)生鐮刀菌并體外檢測(cè)其毒素種類及含量。建立內(nèi)生鐮刀菌與無(wú)菌北美楓香實(shí)生幼苗共培養(yǎng)體系;利用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察菌株在根系組織中形成的侵染結(jié)構(gòu);在正常和鹽脅迫條件下,研究?jī)?nèi)生鐮刀菌對(duì)幼苗生長(zhǎng)和耐鹽性的影響。3個(gè)菌株分別為黃色鐮刀菌(F.culmorum,Class2-1B)、假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum,Class2-1C)和一株未鑒定到種的鐮刀菌(Fusarium sp.,Class2-3)。Class2-1B和Class2-1C對(duì)北美楓香幼苗具有促生和協(xié)助耐鹽的作用,而Class2-3顯現(xiàn)出致病性。(4)內(nèi)生鐮刀菌重測(cè)序與碳代謝分析:以同種或相近種鐮刀菌的全基因組序列為參考,對(duì)3株鹽生植物內(nèi)生鐮刀菌(Class2-1B、Class2-1C和SYC-Root-1)進(jìn)行全基因組重測(cè)序分析,并對(duì)重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)分析。采用BIOLOG真菌板比較分析3株內(nèi)生鐮刀菌的碳代謝活性,以期進(jìn)一步揭示3株鐮刀菌的生理生態(tài)學(xué)特性。(5)內(nèi)生鐮刀菌及彎孢霉GFP轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建:為深入研究三株功能菌株彎孢霉(Curvularia sp.)、黃色鐮刀菌(F.culmorum)和假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)在林木根系的侵染定殖特征以及跟蹤菌株在大田實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際侵染效率,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)獲得綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標(biāo)記的三株菌株。將獲得的標(biāo)記菌株接種至楊樹(shù)幼苗根系共培養(yǎng)14 d以上。熒光顯微觀察表明,三株功能菌株的菌絲可在楊樹(shù)幼苗根系成功侵染定殖。該研究體系為后期有效跟蹤檢測(cè)功能菌株的生態(tài)學(xué)特征奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【圖文】：

過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法獲得菌種資源庫(kù)，，再結(jié)合接種方法來(lái)驗(yàn)證菌株的功能。然而這究策略通常比較耗時(shí)費(fèi)力，更重要的是不能全面反映根際微生物群落對(duì)宿主表型和的調(diào)控效應(yīng)。近年來(lái)，以根系為誘餌、通過(guò)宿主表型來(lái)推測(cè)菌群功能的反向“釣魚(yú)”策經(jīng)在少數(shù)幾種草本植物中開(kāi)展（Mueller and Sachs 2015; Niu et al., 2017; Pankebuissel., 2014），被認(rèn)為是根際微生物組工程未來(lái)的重要研究方向。建立樹(shù)木-微生物群落互型，將加深認(rèn)識(shí)多元土壤微生物群落對(duì)林木生產(chǎn)力和適應(yīng)性的耦合機(jī)制。總之，通向和反向篩選策略、重組根際功能菌群，有望為今后創(chuàng)制新型菌劑、應(yīng)用于高效育林木抗性育種等方面提供新的思路。

1.2.2.4 GFP 轉(zhuǎn)化利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT）獲得綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的 3 株菌株：彎孢霉（Curvularia sp.）R2015-25、黃色鐮刀菌（F. culmorum）Class2-1B 和假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）Class2-1C，觀察上述菌株在楊樹(shù)根系的侵染結(jié)構(gòu)。1.3 研究技術(shù)路線本研究技術(shù)路線詳見(jiàn)圖 1-2。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S727.2;S714

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2602111