【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)Cry2類蛋白對多種鱗翅目害蟲具有殺蟲活性,并且與目前廣泛應用于轉基因作物中的Cry1類蛋白無交互抗性,是轉基因抗蟲作物重要的候選蛋白。目前,獲得命名的cry2類基因共有94個,分為13類模式基因(cry2Aa-cry2Al,cry2Ba)。Cry2類蛋白具有序列相似性高,但是殺蟲活性、殺蟲譜及蛋白表達差異較大的特點。本研究重點圍繞cry2類基因的表達特性開展研究,分析誘導溫度、氨基酸序列差異、分子伴侶等因素對Cry2類蛋白表達的影響。具體包括本實驗室克隆的五種模式的7個cry2類基因(cry2Aa9、cry2Aa17、cry2Ab4、cry2Ab29、cry2Ad2、cry2Ba2、cry2Ah1),分別在大腸桿菌(Escherichia coli)和蘇云金芽胞桿菌中進行了不同條件的表達,主要進展如下:1.分析了相同誘導條件下,不同cry2類基因在大腸桿菌中的表達情況。分別比較了20℃和30℃誘導下Cry2類蛋白表達量差異。其中Cry2Ah1蛋白的表達量均最高。通過比對Cry2Ah1蛋白與其它蛋白的氨基酸序列及三維結構差異,發(fā)現(xiàn)Cry2Ah1蛋白位于DomainⅡβ4與β5之間loop上的第355位缺失了1個氨基酸。對Cry2Ah1蛋白的增加氨基酸突變體Cry2Ahs(354位v變?yōu)閟,355位添加p)、Cry2Ahv(355位添加p)進行相同條件誘導表達,這兩種突變體的蛋白表達量顯著低于Cry2Ah1蛋白,從而證實了Cry2類蛋白表達量與DomainⅡβ4與β5之間loop上的氨基酸數量密切相關。2.比較了在不同溫度誘導下,在大腸桿菌中表達的7種Cry2類蛋白對甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的殺蟲活性,其中Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1四種蛋白對甜菜夜蛾有活性。在20℃誘導的條件下,蛋白濃度為100μg/mL時,Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白對甜菜夜蛾的體重抑制活性分別為42.74%、89.18%、87.02%、85.28%;在30℃誘導的條件下,蛋白濃度為100μg/mL時,Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白對甜菜夜蛾的體重抑制活性分別為0、43.72%、47.48%、70.54%;結果表明Cry2類蛋白的活性受溫度影響,且Cry2Ah1蛋白的活性受溫度影響較小。3.對實驗室先前構建的Cry2Aa蛋白Bt表達載體pHT315-cry2AΔo1進行了改造。通過定點突變的方法將ClaⅠ和NcoⅠ酶切位點引入cry2Aa基因兩端,利用同源重組的方法構建9種cry2類基因的Bt重組表達載體;導入Bt HD73~-無晶體突變株后,9種蛋白均獲得表達。比較了各重組菌對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、小菜蛾(Plutella xylostella)、東方粘蟲(Mythimna separata)、亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物活性,除Cry2Aa9重組菌有活性外,其它重組菌均無明顯活性。4.比較了Bt表達載體中分子伴侶ORF1、ORF2對Cry2類蛋白表達量及蛋白溶解性的影響。在分子伴侶ORF1、ORF2同時存在的情況下,Cry2類蛋白表達量顯著高于ORF2單獨存在,但是ORF1、ORF2同時存在對Cry2類蛋白在堿性溶液中的溶解性無顯著影響。此進展為進一步改造Cry2類蛋白序列、提高蛋白表達及殺蟲活性奠定了基礎。
【圖文】：

1.1.1 蘇云金芽胞桿菌概述蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是革蘭氏陽性細菌，屬于蠟樣芽胞桿菌族，與其它芽胞桿菌的主要區(qū)別是在芽胞形成過程中產生不同形狀的伴胞晶體蛋白（圖1.1）（Didelot, etal., 2009; Schnepf, et al., 1998）。Bt是一種廣泛分布于自然界中的土壤、水域、植物落葉、苔蘚及昆蟲的尸體中的昆蟲病原菌（Reyaz, et al., 2016; Zhang, et al., 2007），其殺蟲活性主要與伴胞晶體有關，它是目前防治農業(yè)、林業(yè)以及公共衛(wèi)生害蟲的最成功的微生物殺蟲劑（Deist, et al., 2014;Zhang, et al., 2016）。伴胞晶體是細菌生長至穩(wěn)定期時產生的晶體狀物質，又稱殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins, ICPs）,包括Cry蛋白和Cyt蛋白（Schnepf, et al., 1998; vanFrankenhuyzen, 2009）。圖1.1 蘇云金芽胞桿菌SWK1菌株的芽胞和晶體Figure 1.1 Spores and crystals of Bt strain SWK1 (Reyaz, et al., 2016)1.1.2 蘇云金芽胞桿菌的分類自 20 世紀初從家蠶（Bombyx mori）中分離得到第一株長桿狀、有芽胞形成的菌株后，相繼從世界各地分離得到一些形態(tài)特征相似、能形成伴胞晶體的芽胞桿菌，各種分類方法也隨即產生（關雄，2006）。最初，研究者們根據 Bt 的形態(tài)特征和生化特性來鑒別不同亞種

蛋白蛋白的分類，H fte 等人根據內毒素氨基序列同源性以及殺蟲活性的相似性將 Cry 蛋種類加羅馬數字表示，對鱗翅目害蟲有活性的為 CryⅠ類蛋白，對鱗翅目和劃分為 CryⅡ類蛋白，對鞘翅目害蟲有活性的屬于 CryⅢ類蛋白，CryIV 是的蛋白（H fte, et al., 1989）。隨著新基因不斷被發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)一些毒素殺蟲差別很大；有的序列同源性很高、殺蟲活性卻大不相同。為了克服這一re 等人開發(fā)了一種新的分類方案。根據該方案，Bt -內毒素命名委員會僅劃分。蛋白質名稱主要由兩部分組成，第一部分是蛋白質的種類及性質，不同等級，將毒素劃分為四個等級（圖 1.2），1、4 等級由阿拉伯數字表寫英文字母和小寫英文字母表示，四個等級劃分是分別以序列相似性 45%rickmore, et al., 1998）。截至 2019 年 3 月，812 個 cry 基因被國際命名委員8 個基因家族。（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S476.1

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