發(fā)布時間：2020-03-23 01:13

【摘要】：十字花科蔬菜由于在長久以來都作為我國人民食用的主要蔬菜,受到了人們在生產(chǎn)生活方面的重視。大猿葉甲作為鞘翅目代表昆蟲,是重要的危害十字花科作物的害蟲。由于十字花科蔬菜的大面積種植,大猿葉甲對其造成嚴重危害并使其大量減產(chǎn),造成巨大經(jīng)濟損失。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種革蘭氏陽性桿狀細菌,目前在農(nóng)業(yè)害蟲防控方面已經(jīng)廣泛應(yīng)用Bt制劑,在對Bt資源的研究中發(fā)現(xiàn),分泌蛋白Sip對鞘翅目昆蟲(如大猿葉甲,CPB等)表現(xiàn)出極高的殺蟲活性,對害蟲的控制具有良好的應(yīng)用前景。而目前研究發(fā)現(xiàn),部分害蟲對Bt制劑也表現(xiàn)除了抗性。所以目前研究者們開始關(guān)注昆蟲的基因組信息,轉(zhuǎn)錄組信息等,以期篩選害蟲應(yīng)答毒素蛋白的靶標基因,從根本上對害蟲進行防控。目前研究大猿葉甲基因進展緩慢,而且至今尚未有人公布大猿葉甲全基因組信息。大猿葉甲的完整轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫在實驗室的前期研究中已經(jīng)取得,得到了SSR標簽相關(guān)信息及其與Sip毒素蛋白互作過程中的信息,發(fā)現(xiàn)與解毒代謝相關(guān)的基因發(fā)生了差異性表達,其中常見的細胞色素P450,核糖體蛋白S8和L14以及肌肉蛋白LIM都發(fā)生了差異性表達。本研究分析了大猿葉甲在Sip毒素蛋白作用前后SSR標簽的PCR擴增差異,發(fā)現(xiàn)被Sip毒素蛋白作用后,PCR擴增條帶大小與Sip蛋白作用前并無差別,但是略呈彌散狀。選擇了P450,S8,L14和LIM這四個差異基因進行PCR擴增,并構(gòu)建原核表達載體,分別表達高效約56 kDa,30 kDa,25 kDa和89 kDa的目的蛋白。分別擴增P450,S8,L14和LIM四個差異基因的核心片段,提取測序正確的正向插入片段和反向插入片段質(zhì)粒,單酶切線性化后以此為模板合成雙鏈RNA,測定RNA濃度并稀釋至5.0μg/μL,注射至3齡/4齡末期大猿葉甲幼蟲體內(nèi)(約2μL),分別注射成功后1d,3d,5d和7d提取中腸進行RT-PCR檢測,結(jié)果顯示,注射一天后,S8,L14和LIM表達量均無明顯變化,而P450的表達量則明顯降低;到了第三天,S8,L14和P450基因表達量已相當微弱,表明干擾成功;而LIM基因到了第三天表達量僅有少許減弱,第五天相比第一天也稍有減弱,但與第三天差距不明顯,直到第七天,基因表達量大幅度減弱,表明干擾成功。分別將未經(jīng)處理的大猿葉甲和RNA干擾后的大猿葉甲飼喂Sip蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在飼喂蛋白12小時后,各組均未見死亡,24小時后,S8死亡率與對照組幾乎無差別,P450死亡率相比于對照組略有下降,L14和LIM死亡率高于對照組;48小時后,L14死亡率略高于對照組,其他均有所下降,但差別不大;從第三天開始,四個干擾組死亡率已明顯高于對照組,直到第七天全部死亡。此結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果大致相符。本研究結(jié)果對篩選大猿葉甲靶標基因,進一步防治大猿葉甲等鞘翅目昆蟲提供了良好的材料,也可以對進一步篩選相應(yīng)的Bt毒素蛋白受體提供新的思路,更為Sip蛋白日后的改造和實際應(yīng)用提供初步的理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 蘇云金芽胞桿菌的芽胞和晶體[47]Figure 1-1 The spore and crystal in Bacillus thuringiensis[47]注：A-F：Bt 菌株的掃描電鏡圖；S：芽胞，C：晶體.4 Sip 蛋白Sip 毒素蛋白是 Bt 殺蟲家族中的分泌型殺蟲蛋白，對鞘翅目幼蟲表現(xiàn)出明顯毒性。在面研究上，Donovan 等人培養(yǎng)了他們隨機挑選的一些 Bt 菌株，在這些菌株的上清液中發(fā)其能夠殺死科羅拉多馬鈴薯甲蟲（CPB）幼蟲，這些研究人員選擇了其中一個菌株進行研究，克隆出包含 1104 個堿基，編碼 367 個氨基酸的新型 Bt 毒素蛋白，并將其命名p1A[48]。將 Sip1A 進行序列比對，發(fā)現(xiàn)其與 Mtx3 之間的相似性為 46％，并且 Sip1A 還起煙草蚜蟲，棉鈴蟲幼蟲和玉米根葉甲蟲的萎縮和體重減輕[48, 49]。劉艷杰等人于 2012 年從 Bt 菌株 QZL26 中鑒定和克隆了 Sip 基因，但并未報道其殺蟲[50]。Murawska 等人于 2013 年使用基因組測序技術(shù)顯示 IS5056 質(zhì)粒 pIS56-328 含有 Siy 等基因，但是他們僅描述了 cry1Aa3，cry1Ah21 和 cry1Ba1 的特征及殺蟲活性，并未對因進行描述[51]。張金波等人在 2015 年克隆了來自 DQ89 Bt 菌株的長度為 1188bp 的 si并顯示其對大猿葉甲有著較高的殺蟲活性[52]。沙君雪于 2017 年在 Bt 菌株 QZL38 中鑒定隆出了長度為 1095，編碼 365 個氨基酸的 sip 基因，其對大猿葉甲具有較高的殺蟲活性

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程碩士學(xué)位論文種的遺傳多樣性[59-60]。沙君雪等對大猿葉甲全蟲進行測序，利從頭組裝獲得大猿葉甲完整轉(zhuǎn)錄譜。從多數(shù)據(jù)庫中對比分析可以參考的大猿葉甲轉(zhuǎn)錄組和 SSR 分子標記的數(shù)據(jù)[61,62]。大實驗室的前期研究中已經(jīng)取得，用其構(gòu)建大猿葉甲基因組文庫00 對引物中篩選出了 22 對多態(tài)性 SSR 引物并進行 PCR 擴增后的研究提供了部分參考。的篩選金芽胞桿菌 Sip 蛋白處理大猿葉甲后差異基因，分別將 pET21白和 1μg·mL-1Sip 蛋白作用于大猿葉甲幼蟲，分別提取 pET21b甲中腸，進行轉(zhuǎn)錄組測序。以閾值: |log2(FoldChange)| > 1 且 q對樣品的測序結(jié)果進行差異表達分析，共獲得 341 個差異表達2。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476.11

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3 吳U，

本文編號：2595923