【摘要】：飛蝗(Locusta migratoria,Lm)是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)害蟲,食性廣泛、生殖能力強(qiáng)大,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損害,其生殖分子機(jī)制的研究對(duì)于蝗災(zāi)治理有重要意義。昆蟲卵黃發(fā)生(Vitellogenesis)是生殖過(guò)程中最重要的環(huán)節(jié)之一,是體現(xiàn)強(qiáng)大生殖能力的基礎(chǔ)。在卵黃發(fā)生期,昆蟲脂肪體合成卵黃原蛋白(Vitellogenin,Vg)并通過(guò)血淋巴運(yùn)輸至卵巢,由卵母細(xì)胞表面的特異性受體—卵黃原蛋白受體(Vitellogenin receptor,VgR)介導(dǎo)并吸收,繼而在胞內(nèi)加工成為卵黃蛋白(Vitellin,Vn),構(gòu)成昆蟲胚胎發(fā)育的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。VgR在Vg吸收環(huán)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色,其中分子機(jī)制的解析一直受到領(lǐng)域科學(xué)家們的關(guān)注。昆蟲卵黃原蛋白受體屬于低密度脂蛋白受體超家族(Low density lipoprotein receptor,LDLR)成員,目前為止,已有30多種昆蟲的VgRs家族成員被研究報(bào)道,其中關(guān)于飛蝗VgR的研究顯示,其介導(dǎo)Vg吸收過(guò)程受到體內(nèi)保幼激素(juvenile hormone,JH)調(diào)控。JH是昆蟲體內(nèi)最重要內(nèi)分泌激素之一,在昆蟲生殖發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用,然而由于JH信號(hào)通路研究進(jìn)展較為緩慢,導(dǎo)致VgR受體介導(dǎo)卵母細(xì)胞吸收Vg的分子調(diào)控機(jī)制至今未明。因此,本論文以飛蝗作為研究對(duì)象,從飛蝗VgR功能解析著手,通過(guò)生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)手段,對(duì)LmVgR受體功能及上游JH調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,以期解析JH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活VgR并介導(dǎo)卵母細(xì)胞吸收Vg的分子機(jī)制。首先通過(guò)已知飛蝗VgR基因序列片段并借助RACE技術(shù)獲取了飛蝗VgR基因序列全長(zhǎng)。利用生物信息學(xué)方法對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化水平進(jìn)行分析,獲得了LmVgR序列的生物學(xué)信息。運(yùn)用原核重組表達(dá)技術(shù)重組表達(dá)VgR部分片段,經(jīng)純化并免疫新西蘭大白兔后制備LmVgR多克隆抗體。然后使用熒光定量PCR和Western Blot等分別從mRNA與蛋白水平上檢測(cè)了LmVgR的表達(dá)模式,結(jié)合飛蝗卵巢中LmVg的變化模式,發(fā)現(xiàn)LmVgR表達(dá)與卵巢吸收Vg呈現(xiàn)正相關(guān)性�；赗NAi的LmVgR基因沉默實(shí)驗(yàn)顯示,LmVgR干擾后卵巢對(duì)LmVg的吸收顯著下降。JH體內(nèi)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示,JH能夠顯著提升卵巢對(duì)LmVg的吸收;LmVgR沉默能夠顯著抑制JH誘導(dǎo)下卵巢吸收LmVg。上述結(jié)果表明,JH能夠通過(guò)LmVgR促進(jìn)飛蝗卵巢吸收Vg。飛蝗卵巢發(fā)育階段Western blot顯示,LmVgR的蛋白表達(dá)模式存在翻譯后修飾,并且其翻譯后修飾與卵巢Vg吸收也呈現(xiàn)正相關(guān)性。通過(guò)堿性磷酸酶處理以及基于VgR抗體、蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)底物磷酸化抗體的IP和Western blot實(shí)驗(yàn)確定VgR存在磷酸化修飾,且該修飾為PKC催化的絲氨酸磷酸化。通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,JH能夠顯著誘導(dǎo)VgR磷酸化修飾,并且PKC抑制劑(Staurosporine)顯著抑制JH誘導(dǎo)的VgR磷酸化修飾,然而,鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(calcium/calmodulindependent protein kinase II,CaMK II)的抑制劑(KN-93)不能抑制JH誘導(dǎo)的VgR磷酸修飾。進(jìn)一步通過(guò)受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)抑制劑SU6668、G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor,GPCR)抑制劑Suramin和磷酯酶C(phospholipase C,PLC)抑制劑U73122等進(jìn)行阻斷處理,結(jié)果顯示,Suramin與U73122能夠顯著抑制JH誘導(dǎo)LmVgR磷酸化。通過(guò)卵巢吸收功能研究發(fā)現(xiàn),JH促進(jìn)卵巢吸收Vg,并且PKC抑制劑Staurosporine能夠顯著抑制卵巢對(duì)Vg吸收。免疫共沉淀顯示,JH能夠觸發(fā)VgR-Vg之間相互作用,并且Staurosporine能夠顯著抑制VgR與Vg相互結(jié)合。上述結(jié)果暗示了JH能夠通過(guò)GPCR-,PLC-,PKC-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控VgR磷酸化修飾,繼而調(diào)節(jié)VgR與Vg之間相互作用及卵巢吸收Vg。本論文研究結(jié)果表明,JH能夠通過(guò)PKC激活LmVgR的磷酸化,進(jìn)而調(diào)控LmVgR與LmVg的結(jié)合,從而介導(dǎo)卵母細(xì)胞對(duì)卵黃原蛋白吸收,從而初步解析了保幼激素激活飛蝗VgR并介導(dǎo)卵巢吸收Vg的分子機(jī)制。研究結(jié)果豐富了JH非基因組信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其在昆蟲生殖發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究中的進(jìn)展,為飛蝗綠色防控提供了一定的借鑒意義。
【圖文】：

圖 3-1 飛蝗 VgR 功能結(jié)構(gòu)域圖。為 ExpasyTMHMM2.0 與 SMART 對(duì)飛蝗 VgR 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)整合后的結(jié)果，包含該家族的五種經(jīng)域，以不同的色塊表示不同的結(jié)構(gòu)。其中，棕色為信號(hào)肽，藍(lán)色為 A 型重復(fù)序列，黃色為 B 序列，橙色為 YWXD 重復(fù)基序，紅色為 O-型糖基化位點(diǎn)，綠色為跨膜域，紫色為胞質(zhì)尾域。Figure 3-1 Functional structure domain of LmVgR.同時(shí)利用 MEGA 6.0 將飛蝗 VgR 與已知的二十多種其他昆蟲的 VgR 和脊椎動(dòng)物L(fēng)R 進(jìn)行同源比對(duì)，，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖 3-2）。結(jié)果證明，整個(gè) LDLR 超家別是昆蟲的VgRs之間具有著的高度保守性和同源性，飛蝗VgR與蜚蠊目昆蟲的V有最高的同源性，其次是膜翅目的 VgRs。

圖 3-2 LDLR 超家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用 MAGE 5.0 進(jìn)行分析作圖，涉及的序列號(hào)如下：SinVgR (AAP92450.1), HsaVgR (EFN84770.MroVgR (XP_003704660.1),AmeVgR (XP_001121707.2), NviVgR (XP_001602954.2), PamVgR(BAC02725.2), BgeVgR (CAJ19121.1), RmaVgR (BAE93218.1), NluVgR (ADE34166),ApisLDLR(XP_001944152.2), BtaVgR (ADM34986.1), PhuVgR (XP_002423121.1), TcaVgR (XP_968903.2),aeVgR (AAK15810.1),AgaVgR (EAA06264.6), BdoVgR (AGE83235.1), DmeVgR (GI21507), DplV(EHJ76019.1), HarVgR (AGF33811.1), SliVgR (ADK94033.1),AseVgR (AFV32171.1),ApeVgR(AEJ88360.1), BmoVgR (ADK94452.1), PmoVgR (ABW79798.1), MroVgR (ADK55596.1), DvaVg(AAZ31260.3),Ahe (AGQ57038.1), GgaVLDLR (NP_990560.1), XlaVLDLR (NP_001084168.1),HsaLDLR (EAX11280.1), PabLDLR (XP_002812613.1),AmeLDLR (XP_002916562.1), PhoLDLR(XP_005977011.1), BtaLDLR (DAA32788.1)。Figure 3-2 Phylogenetic tree for LDLR superfamily..1.2 飛蝗 VgR 特異性抗體制備為便于后續(xù)對(duì)飛蝗 VgR 功能的研究，我們著手制備了飛蝗 VgR 的特異性兔源多
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S433.2

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本文編號(hào)：2592127