【摘要】：【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii)P450 CYP6CY3,將其開(kāi)放閱讀框(ORF)在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),純化融合蛋白,多次免疫小鼠獲得CYP6CY3多克隆抗體,為進(jìn)一步分析CYP6CY3在棉蚜不同組織部位的分布及其在抗性中的作用打下基礎(chǔ)。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技術(shù)克隆獲得CYP6CY3的ORF,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)及系統(tǒng)進(jìn)化分析。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-CYP6CY3,轉(zhuǎn)化大腸桿菌transetta(DE3)進(jìn)行原核表達(dá),利用切膠回收法獲得純化的融合蛋白,繼而用純化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制備鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗體;ELISA檢測(cè)鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗體的效價(jià),并通過(guò)Western blot及免疫組化檢測(cè)該抗體特異性�！窘Y(jié)果】棉蚜CYP6CY3 ORF長(zhǎng)1 266 bp,編碼421個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子量為48.8 k D,理論等電點(diǎn)為8.99,不含有信號(hào)肽序列,屬親水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5個(gè)P450家族的特征基序。通過(guò)NCBI Blastx進(jìn)行同源序列的比對(duì)分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列與豌豆長(zhǎng)管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,達(dá)到81%,與麥雙尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性為79%,與桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性為76%,4種蚜蟲(chóng)的氨基酸序列都含有位于螺旋K中參與穩(wěn)定核心結(jié)構(gòu)的E××R完全保守序列及P450基因標(biāo)志性的F××G×××C×G(358—367)血紅素結(jié)合位點(diǎn)的共有序列。使用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),顯示棉蚜、豌豆長(zhǎng)管蚜、麥雙尾蚜及桃蚜聚為一類(lèi),親緣關(guān)系較近。通過(guò)原核表達(dá)得到的CYP6CY3融合蛋白的相對(duì)分子量約為66 k D,基于純化的CYP6CY3重組蛋白多次免疫昆明白小鼠制備多克隆抗體,ELISA檢測(cè)獲得的鼠抗CYP6CY3抗體效價(jià)達(dá)到1㑳409 600。Western blot和免疫組化進(jìn)一步證實(shí),該抗體既能與異源表達(dá)的CYP6CY3蛋白特異性結(jié)合,也能與棉蚜組織中存在的天然CYP6CY3蛋白特異性結(jié)合,具有較好的免疫反應(yīng)特異性�！窘Y(jié)論】利用3′-RACE技術(shù)克隆獲得CYP6CY3的開(kāi)放閱讀框,并用異源表達(dá)的蛋白免疫昆明白小鼠制備了高滴度、特異性強(qiáng)的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗體,可用于進(jìn)一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗藥性方面的作用。
【圖文】：

7期魏原杰等：棉蚜P450CYP6CY3的克壟原核表達(dá)及多克隆抗體的制備1355200010007505002501002000100075050025010020001000750500250100bpbpbpM1M--2M3--ABCA：CYP6CY3部分序列PCR產(chǎn)物PartialsequencePCRproductofCYP6CY3；M：DNAMarker；1：PCR產(chǎn)物PCRproduct。B：3′-RACE產(chǎn)物3′-RACEproduct；2：第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第2輪的模板擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物PCRproductwas100timesdilutedandthentakenasthetemplateofthelaterPCR。C：ORF擴(kuò)增AmplificationoftheORF；3：PCR產(chǎn)物PCRproduct；--：陰性對(duì)照Negativecontrol圖1棉蚜CYP6CY3擴(kuò)增Fig.1AmplificationofCYP6CY3fromA.gossypii1176261515122676301101376126451151526176601201676226751251826276901301976326105135111263761201401方框內(nèi)為起始和終止密碼子Insidetheboxforthestartandstopcodons；CYP6CY3蛋白保守結(jié)構(gòu)域：W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G用下劃線標(biāo)出CYP6CY3conservedmotifsincludingW×××R,AG××T,E××R,P××F×PE/DRTandF××G×××C×Gwereunderlinedinbold圖2棉蚜CYP6CY3的開(kāi)放閱讀框核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2ORFsequenceandthededucedaminoacidsequenceofCYP6CY3fromA.gossypii無(wú)信號(hào)肽序列（圖3-A），ProtScale分析平均疏水性指數(shù)為-0.192，屬親水性蛋白（圖3-B）。通過(guò)NCBIBlastx進(jìn)行同源序列的比對(duì)分析，結(jié)果顯示，棉蚜CYP6CY3氨基酸序列與豌豆長(zhǎng)管蚜

鶚敲舾釁廢檔?4、59倍[20]，這與石緒根[11]的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明了該基因在禾谷縊管蚜及棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉產(chǎn)生抗性中具有重要作用。1701301007055403525M1BabkDA100μm100μmA：多克隆抗體與融合蛋白His-CYP6CY3Westernblot鑒定PolyclonalantibodycombinedwithHis-CYP6CY3fusionproteinspecificityofdetectionWesternblot；M：蛋白MarkerProteinMarker；1：融合蛋白Fusionprotein。B：免疫組化Immunohistochemistry；a：免疫前血清Pre-immuneserum；b：免疫后血清Afterimmunizationserum圖8多克隆抗體與CYP6CY3特異性結(jié)合的檢測(cè)Fig.8DetectionofpolyclonalantibodyspecificitybindingtoCYP6CY3隨著分子生物學(xué)和DNA重組技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于P450的異源表達(dá)系統(tǒng)常用的有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[21]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有表達(dá)水平高，技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)，但其不能夠進(jìn)行翻譯后修飾表達(dá)出的大部分真核蛋白不具有生物活性[21]。目前已有的報(bào)道使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450酶基因有棉鈴蟲(chóng)CYP6B7[22]和CYP6B6[23]以及微小按蚊CYP6AA3[24]，，褐飛虱CYP4C62[25]等基因。筆者研究組前期已經(jīng)成功在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了棉鈴蟲(chóng)的CYP6B6蛋白，并制備得到了特異性好效價(jià)高的多克隆抗體[12,23]。所以在本研究中通過(guò)3′-RACE克隆得到了CYP6CY3ORF，然后利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)并純化了CYP6CY3融合蛋白。His-CYP6CY3為包涵體蛋白，不具備生物活性，而制備多克隆抗體不需要得到其具有生物活性的蛋白，并且包涵體表達(dá)量大，可以純化得到大量目的蛋白[12]。采用切膠回收的方法純化包涵體蛋
【作者單位】： 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金-新疆聯(lián)合基金(U1603331) 新疆自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程(qn2015yx001)
【分類(lèi)號(hào)】：S433.39


本文編號(hào)：2539588