【摘要】：我國(guó)水稻秸稈資源豐富,但由于其難降解的特征,限制了其開(kāi)發(fā)利用。利用微生物資源實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻秸稈資源的降解研究,已日趨成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。Pantoea ananatis Sd-1是本實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株具有高效降解水稻秸稈能力的水稻內(nèi)生細(xì)菌,為了進(jìn)一步探索Sd-1降解水稻秸稈的條件及其對(duì)木質(zhì)纖維素材料的降解機(jī)理,本文主要開(kāi)展了以下三部分的研究。(1)最佳條件探索與成分分析利用水稻秸稈為唯一碳源,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與三因素三水平的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到了Sd-1降解水稻秸稈的最佳組合條件為接種量1.5%、pH10、秸稈含量2.5%,在該條件下,Sd-1對(duì)秸稈的降解率為46%。以預(yù)處理水稻秸稈為唯一碳源,連續(xù)6天研究了Sd-1對(duì)預(yù)處理水稻秸稈的降解率,在第3天達(dá)到最大值61.8%。通過(guò)GC-MS分析預(yù)處理秸稈降解后發(fā)酵液的成分,鑒定出了一些構(gòu)成木質(zhì)素的低分子苯化合物(如苯酚、苯乙酸等)以及一些酸類物質(zhì)。(2)酶活變化與降解能力的研究定性培養(yǎng)基檢測(cè),確定了Sd-1具有分泌過(guò)氧化物酶、漆酶、纖維素酶和半纖維素酶的能力。以預(yù)處理秸稈為唯一碳源,連續(xù)6天檢測(cè)了上述四種木質(zhì)纖維素降解酶在秸稈降解過(guò)程中的活性變化,發(fā)現(xiàn)Sd-1產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、漆酶和纖維素酶的活性均在第3天達(dá)到最大值,分別為5.9 U/mL、600 U/L和295 U/mL,而產(chǎn)生的半纖維素酶在第一天即達(dá)到最大值1345 U/mL。通過(guò)對(duì)預(yù)處理秸稈中的木質(zhì)纖維素組分含量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)Sd-1對(duì)秸稈中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率在第六天分別達(dá)到了35.62%、78.8%和75.2%。(3)漆酶的克隆與純化通過(guò)對(duì)Sd-1全基因組的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)四段CDS序列(lac1-lac4)可能編碼漆酶。進(jìn)一步的進(jìn)化樹(shù)分析、同源序列分析與三維結(jié)構(gòu)分析,確定Lac4為典型的細(xì)菌漆酶。對(duì)Lac4進(jìn)行克隆與原核表達(dá),SDS-PAGE顯示其分子量約為60 kDa,Lac4酶活在以ABTS為底物時(shí)的最佳pH為2.5,在愈創(chuàng)木酚為底物時(shí)的pH為4.5。Lac4具有極度耐酸性,金屬離子穩(wěn)定性且受到Fe2+與Cu2+顯著促進(jìn)。Lac4具有氧化非酚型(ABTS)和酚型(愈創(chuàng)木酚)化合物的能力,對(duì)ABTS的親和性Km值達(dá)到1.03±0.154 mM。Lac4具有使染料脫色能力,尤其是能快速有效使剛果紅脫色,在有介質(zhì)ABTS的存在下,其脫色率可達(dá)89%;Lac4在體外試驗(yàn)中能使木質(zhì)素的降解率達(dá)到38%,通過(guò)GC-MS分析Lac4降解木質(zhì)素后的產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)了一些小分子的苯環(huán)化合物如苯酚、鄰苯二甲醛、苯二酚、苯乙酸等,進(jìn)一步說(shuō)明Lac4具有降解木質(zhì)素成小分子物質(zhì)的能力。另外通過(guò)定量PCR檢測(cè)Lac4在預(yù)處理水稻秸稈培養(yǎng)基中的表達(dá)水平,其結(jié)果說(shuō)明Lac4的表達(dá)受到木質(zhì)纖維素的誘導(dǎo)。
【圖文】：

內(nèi)生細(xì)菌 Pantoea ananatis Sd-1 降解水稻秸稈性能與漆酶催化性質(zhì)的研究賴 Fe3+和 Fe4+，通過(guò)多步的電子傳遞和形成一些中間自由基（如苯氧基和二甲氧基芐醇基離子）氧化底物，這些中間自由基能夠承受非酶促氧化反應(yīng)，如自由基的偶聯(lián)聚合作用、側(cè)鏈的切除、脫甲基作用和內(nèi)部分子的疊加與重排[21]。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶不同于其他的過(guò)氧化物酶（如錳過(guò)氧化物酶），木質(zhì)素過(guò)氧化物酶具有氧化非酚型芳香化合物的能力，在氧化的過(guò)程中不需要介質(zhì)的參加，因?yàn)槟举|(zhì)素過(guò)氧化物酶本身就具有很高氧化還原電勢(shì), LiP 的氧化還原電勢(shì)可以達(dá)到 1.4 V[21-22]。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的晶體結(jié)構(gòu)顯示其催化氧化活性中心血紅素基團(tuán)被埋在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，必須通過(guò)一個(gè)通道才能進(jìn)入外部的媒介發(fā)揮作用，盡管通道的大小不足以讓大分子聚合物木質(zhì)素與埋在木質(zhì)素過(guò)氧化物酶內(nèi)部的血紅素基團(tuán)連接，但是一些小的分子基團(tuán)可以找到適合的分子結(jié)合位點(diǎn)[23]。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶催化作用過(guò)程中的電子循環(huán)圖如圖 1.2 所示[24-25]。

圖 1.3 MnP 依賴過(guò)氧化氫和金屬離子氧化催化過(guò)程中的電子傳遞循環(huán)示意圖[24]1.3.5 多樣過(guò)氧化物酶 (Versatile peroxidases)多樣過(guò)氧化物酶 (EC 1.11.1.16) 也是一種含有血紅素的木質(zhì)素降解過(guò)氧化物酶，具有結(jié)合木質(zhì)過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶的混合型分子結(jié)構(gòu)。多樣過(guò)氧化物酶分子量在35~40 kDa 之間，等電點(diǎn)為 3.7[32-33]。多樣過(guò)氧化物酶首次在白腐真菌 Pleurotus eryngii[34]中報(bào)道。隨后，越來(lái)越多的多樣過(guò)氧化物酶在其他的擔(dān)子菌中被發(fā)現(xiàn)，Bjerkanderafumosa[35]和 Pleurotus pulmonarius[36]均報(bào)道具有產(chǎn)生多樣過(guò)氧化物酶的能力。多樣過(guò)氧化物酶同時(shí)具有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）和錳過(guò)氧化物酶（MnP）的催化活性，，能夠氧化 Mn2+，形成 Mn3+，催化藜蘆醇、染料和酚型與非酚型的芳香化合物[24]。多樣過(guò)氧化物酶的催化機(jī)制是結(jié)合 LiP 與 MnP 的催化電子傳遞循環(huán)機(jī)制[37]。但是這種酶的催化機(jī)制不同于典型的錳過(guò)氧化物酶，在催化的過(guò)程中，多樣過(guò)氧化物酶是不依賴 Mn2+，氧化結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的胺類物質(zhì)和酚型單體物質(zhì)[34]。在木質(zhì)素降解的過(guò)氧化物酶中，多樣過(guò)氧化物酶由于其催化的多樣性，包括多樣過(guò)氧化物酶也不同于其他過(guò)氧化物酶，它能直接氧化底物，因此在工業(yè)生物技術(shù)上的應(yīng)用具有很大的吸引力。但是多樣過(guò)
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S38;S182

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 沈其榮,徐勇,楊紅,周立祥,郁清,周志萍;化學(xué)處理水稻秸稈水溶性有機(jī)物的光譜特征研究[J];光譜學(xué)與光譜分析;2005年02期

2 葉文培;王凱榮;Johnson SE;謝小立;;添加玉米和水稻秸稈對(duì)淹水土壤pH、二氧化碳及交換態(tài)銨的影響[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2008年02期

3 畢春鵬;李海群;喬雪;吳月;姜治民;孫軍德;;水稻秸稈降解菌的篩選[J];農(nóng)業(yè)科技與裝備;2014年06期

4 趙明文,史玉英,李玉祥,婁無(wú)忌;纖維分解菌群對(duì)水稻秸稈田間腐熟效果的研究[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2000年01期

5 李自剛;李興道;蔣媛媛;邊傳周;介曉磊;趙躍進(jìn);;水稻秸稈還田對(duì)河南沿黃稻區(qū)土壤細(xì)菌群落分子多態(tài)性影響[J];河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年01期

6 ;一畝稻草“創(chuàng)”三千效益[J];科技致富向?qū)?2007年09期

7 古小敏;吳宏海;張立國(guó);李靜;劉曉華;管玉峰;;水稻秸稈和椰殼生物質(zhì)碳對(duì)菲的吸附動(dòng)力學(xué)對(duì)比[J];地球科學(xué)與環(huán)境學(xué)報(bào);2012年04期

8 趙莉;孫紅文;何娜;;水稻秸稈主要組分的提取及其對(duì)芘的吸附作用[J];環(huán)境科學(xué);2010年06期

9 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張興;王儀明;張瑾;范占煉;;水稻秸稈半干青貯工藝條件及飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究[A];第二屆中國(guó)奶業(yè)大會(huì)論文集(上冊(cè))[C];2011年

2 謝占玲;何智媛;;四株不同屬真菌粗酶液協(xié)同降解水稻秸稈效果的比較研究[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2009年

3 姬登祥;黃承潔;于平;于鳳文;艾寧;計(jì)建炳;;原料預(yù)處理對(duì)生物質(zhì)熱裂解動(dòng)力學(xué)特性的影響[A];全國(guó)農(nóng)村清潔能源與低碳技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

4 顧金剛;李世貴;龔明波;馮新光;姜瑞波;;水稻秸稈腐熟對(duì)土壤微生物及土壤理化指標(biāo)的影響[A];第三屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì)會(huì)議論文摘要集[C];2011年

5 楊陽(yáng);張毅敏;練建軍;段金程;周創(chuàng);林超;;改性炭化水稻秸稈的制備及其表征[A];2013中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（第五卷）[C];2013年

6 王曉琳;張弘s

本文編號(hào)：2530680