【摘要】：【目的】比較傳統(tǒng)顯微計數、單細胞分選和現代分子方法研究典型水稻土微生物組的細胞數量、物種組成及好氧甲烷氧化菌生理生態(tài)過程的技術特點�！痉椒ā酷槍λ就林锌商崛∥⑸锛毎�(土壤細胞)及其DNA(細胞DNA)、單細胞DNA、土壤微生物組總DNA(土壤DNA),利用傳統(tǒng)顯微計數和實時熒光定量PCR(qPCR)方法,研究水稻土好氧甲烷氧化過程中微生物數量的變化規(guī)律;通過高通量測序16S rRNA基因技術,研究微生物物種組成的變化規(guī)律。【結果】水稻土微生物組的傳統(tǒng)顯微計數結果顯著低于現代分子方法 qPCR,最高可達3個數量級。基于DAPI染色、CARD-FISH、細胞DNA及土壤DNA的qPCR定量結果分別為:(5.8 7.4)×10~7、(1.7 1.9)×10~7、(2.8 6.3)×10~8、(1.5 2.7)×10~(10) cells/g�；趒PCR的水稻土好氧甲烷氧化菌數量為1.1×10~7 cells/g,比傳統(tǒng)顯微計數方法高3個數量級。然而,當水稻土氧化高濃度甲烷后,所有方法均發(fā)現甲烷氧化菌顯著增加,增幅分別為54倍(CARD-FISH)、388倍(細胞DNA)和45倍(土壤DNA)。在微生物分類學門的水平,細胞DNA(25個門)與土壤DNA(30個門)結果基本一致,均能較好地反映水稻土微生物組的群落結構,而單細胞DNA盡管檢測到20個門,但偏好性較大,95%以上均為Proteobacteria。在微生物分類學屬的水平,土壤DNA、細胞DNA和單細胞DNA分析均表明背景土壤含有7個好氧甲烷氧化菌的pmo A基因型,但氧化高濃度甲烷后,γ-Proteobacteria的2個屬Methylobacter/Methylosarcina則成為優(yōu)勢類群。【結論】土壤微生物的傳統(tǒng)顯微計數(DAPI和CARD-FISH)結果顯著低于qPCR技術,相差1 3個數量級。qPCR定量土壤DNA和細胞DNA表明:水稻土可提取微生物細胞約占土壤微生物總量的2%左右,而好氧甲烷氧化菌的提取效率最高可達6%。細胞DNA在門水平能較好地反映水稻土微生物組成,但在屬水平和土壤DNA有著較大差異。Planctomycetes微生物門的細胞易被提取,Acidobacteria門的微生物則較難被提取,而單細胞分選技術則偏好Proteobacteria。盡管傳統(tǒng)方法和分子技術的分辨率明顯不同,但均能較好地表征水稻土甲烷氧化的微生物生理生態(tài)過程。未來土壤微生物組研究應更加重視科學問題本身對技術手段的內在需求,最大限度發(fā)揮各種先進技術的優(yōu)勢。
【圖文】：

5%，總有機碳15g/kg，總氮1.59g/kg，總磷1.23g/kg，pH7.4(水土比2.5)[13]。1.1.2實驗技術路線：如圖1所示，每個土壤可獲得4種不同的樣品：直接提取的土壤微生物細胞(土壤細胞)、從土壤細胞懸液進一步提取的細胞DNA(細胞DNA)、從土壤細胞懸液經單細胞分選及全基因組擴增后獲得的DNA(單細胞DNA)和直接提取的土壤微生物總DNA(土壤DNA)。(1)針對水稻土微生物組的數量：采用DAPI染色和CARD-FISH雜交兩種顯微計數方法，分析土壤細胞數量；采用qPCR分子技術分析細胞DNA和土壤DNA中微生物基因數量。(2)針對水稻土微生圖1.實驗整體思路和技術流程Figure1.Flowdiagramofthestudy.物的物種組成：采用高通量測序16SrRNA和pmoA基因的方法，分析土壤DNA、細胞DNA、單細胞DNA中的微生物組成。水稻土樣品則來自高濃度甲烷氧化前后，即零時刻的背景土壤(Day0)和氧化了600μmol甲烷的水稻土(Day-17)。最后比較傳統(tǒng)顯微計數、現代分子方法研究土壤微生物組的數量、組成及好氧甲烷氧化微生物生理生態(tài)過程的技術特點。1.1.3水稻土好氧甲烷氧化微生物過程：調整土壤含水量至最大持水量的60%(實際含水量33%)，在無菌封口袋中充分混勻后，28°C預培養(yǎng)4d，使土壤微生物充分活化。取8g作為0時刻樣品(Day0)， 20°C保存用于總DNA及土壤細胞的提齲其余土樣用于微宇宙培養(yǎng)。在120mL血清瓶中加入8g水稻土，，設置3個平行，用丁基橡膠塞密封后用鋁蓋封口，抽真空后，用注射器注入14.4mLCH4，36mLO2，并用N2補充至1個大氣壓，甲烷初始濃度約85.7g/m3，28°C避光培養(yǎng)。前10d每天監(jiān)測1次CH4濃度，10d后每3 4d監(jiān)測1次。待瓶內甲烷濃度降至7.14g/m3以下(第17天)終止實驗，取出土壤保存于 20°C用于總DNA及土壤細胞的提齲培養(yǎng)

賈仲君等|微生物學報,2017,57(6)907http://journals.im.ac.cn/actamicrocn圖2.水稻土氧化甲烷的動力學過程(A)及土壤總微生物(B)與甲烷氧化菌(C)的數量變化Figure2.Consumptiondynamicsofmethanebypaddysoil(A),copynumberchangesof16SrRNA(B)andpmoAgenes(C)in1gwetweightsoil(wws)orincellsexractedfrom1gwetweightsoilbeforeandaftermethaneincubation.Errorbarsrepresentstandarddeviations(n=3),andcolumnswiththedifferentlettersaresignificantlydifferent(P<0.05)byone-wayANOVA.2.3基于DAPI染色和CARD-FISH雜交的土壤微生物組及甲烷氧化菌數量比較通過DAPI染色及CARD-FISH計數對土壤可提取微生物細胞計數。如圖3-A所示，Day0樣本中總微生物細胞的DAPI計數為5.8×107cells/g，Day17樣本中略微增加至7.4×107cells/g。而CARD-FISH的計數結果分別為1.7×107cells/g(Day0)和1.9×107cells/g(Day17)(圖3-B)。DAPI染色的靈敏度更高，是CARD-FISH計數結果的3 4倍。利用TypeI和TypeII甲烷氧化菌的特異探針進行CARD-FISH計數，結果表明高濃度甲烷氧化過程中，好氧甲烷氧化菌的數量顯著增加(圖3-C，D)。零時刻甲烷氧化菌數量較低，TypeI甲烷氧化菌約1.6×104cells/g，TypeII甲烷氧化菌約2.1×104cells/g；而高濃度甲烷培養(yǎng)后(Day17)，兩類甲烷氧化菌數量均顯著增加(t-test，P<0.01)，TypeI甲烷氧化菌數量增加至1.7×106cells/g，增加100倍左右(圖3-C)。TypeII甲烷氧化菌增加到4.1×104cells/g，增加1倍左右(圖3-D)。Day0水稻土中甲烷氧化菌總量約3.7×104cells/g；Day17則增加至1.7×106cells/g，增幅約45倍。2.4基于高通量測序的土壤微生物組成分析在微生物分類學門的水平，高通量測序
【作者單位】： 中國科學院南京土壤研究所土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室;中國科學院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室;
【基金】：中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項(B類)項目(XDB15040000) 國家自然科學基金青年基金(41401294)~~
【分類號】：S154.3

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;加科學家發(fā)現新甲烷氧化菌[J];中國科技獎勵;2007年12期

2 周葉鋒;廖曉蘭;黃璜;傅志強;張亞;;甲烷氧化細菌氧化活性影響因素的研究[J];微生物學雜志;2008年03期

3 ;利用甲烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的方法[J];化工科技市場;2009年10期

4 辛嘉英;董靜;閆超澤;喬君;梁洪野;夏春谷;;甲烷氧化菌素的產生和銅捕獲作用[J];中國生物工程雜志;2011年08期

5 曹亞彬;殷博;牛彥波;甄濤;吳皓瓊;郭立姝;何鑫;;甲烷氧化菌的研究進展[J];生物技術世界;2012年06期

6 張震元;;利用甲烷氧化菌生產化學制品[J];微生物學雜志;1985年01期

7 鄭中華;趙樹杰;;甲烷氧化細菌的電子顯微鏡觀察[J];微生物學報;1988年04期

8 趙樹杰;張玉英;鄭堅;陳景茹;陳耀初;彭莉;李皓;蔡鍵;;甲烷氧化細菌的一個新種[J];微生物學報;1989年02期

9 鄭堅;吳衍庸;;惰性氣體內標法在甲烷氧化菌檢測中的應用[J];微生物學雜志;1989年02期

10 劉穎,閔航,陳美慈,程克明;甲烷氧化菌分離物的分離及其特性[J];上海鐵道大學學報(醫(yī)學輯);2000年11期

相關會議論文 前5條

1 陳亮;趙春貴;;甲烷氧化菌甲烷氧化酶代謝甲烷活性影響因素的研究[A];泛環(huán)渤海地區(qū)九省市生物化學與分子生物學會——2011年學術交流會論文集[C];2011年

2 邢新會;羅明芳;吳昊;王磊;;甲烷氧化混合菌群結構和功能解析[A];中國生態(tài)學會2006學術年會論文薈萃[C];2006年

3 鄭中華;;甲烷氧化細菌的冷凍蝕刻電鏡觀察[A];第五次全國電子顯微學會議論文摘要集[C];1988年

4 邢志林;高艷輝;趙天濤;;甲烷氧化菌群共代謝降解TCE研究[A];2014中國環(huán)境科學學會學術年會（第十、十一章）[C];2014年

5 吳昊;邢新會;緱仲軒;;高密度培養(yǎng)甲烷氧化菌的研究[A];第三屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集（上）[C];2006年

相關博士學位論文 前4條

1 魯霞;環(huán)境微生物與鈾和汞的相互作用和機理[D];蘭州大學;2016年

2 武超;淡水環(huán)境中新型酯酶和甲烷氧化菌的篩選與鑒定[D];中國科學技術大學;2009年

3 韓冰;甲烷氧化菌的微生態(tài)解析及其應用基礎研究[D];清華大學;2008年

4 江皓;甲烷氧化混合菌群的富集培養(yǎng)及其治理瓦斯工藝研究[D];清華大學;2010年

相關碩士學位論文 前10條

1 周葉鋒;甲烷氧化菌的分離及氧化活性的影響因子研究[D];湖南農業(yè)大學;2008年

2 邢志林;功能覆蓋材料強化無序甲烷氧化的生物效應與機理研究[D];重慶理工大學;2015年

3 魯水龍;氨/甲烷氧化微生物全球海洋分布格局研究[D];復旦大學;2013年

4 王潔;互花米草入侵對濱海濕地甲烷氧化速率和甲烷氧化菌群落結構影響研究[D];西南大學;2016年

5 魏曉夢;填埋場覆蓋土及甲烷氧化菌氧化CH_4過程中的胞外多聚物形成及影響因子研究[D];浙江大學;2016年

6 陳亮;甲烷氧化菌甲烷氧化活性的影響因素和甲醇含量測定方法的研究[D];山西大學;2011年

7 閆超澤;甲烷氧化菌素檢測、生物合成及結構表征[D];哈爾濱商業(yè)大學;2012年

8 楊芊葆;長期不同施肥對中國東北黑土甲烷氧化菌群落特征與功能的影響[D];甘肅農業(yè)大學;2010年

9 姜加良;甲烷氧化菌素的生物合成及模擬過氧化物酶研究[D];哈爾濱商業(yè)大學;2013年

10 魏聰;甲烷氧化菌分離鑒定及其對煤樣中甲烷降解能力的研究[D];河南師范大學;2013年

本文編號：2521664