本文選題：芽孢桿菌　切入點：促生　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：根際促生細(xì)菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指生存在根際范圍內(nèi),對植物生長有促進(jìn)或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸婕?xì)菌的統(tǒng)稱。目前已報道的促生機(jī)制包括提高氮、磷等營養(yǎng)元素的可利用性,分泌生長素、分裂素、赤霉素等植物激素,產(chǎn)生ACC脫氨酶降低植物體內(nèi)乙烯含量,產(chǎn)生2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮等揮發(fā)性物質(zhì)等。芽孢桿菌是一類重要的根際促生細(xì)菌,由于其能產(chǎn)生抗逆性強的芽孢、對環(huán)境和人畜安全等特性而被廣泛地應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌OKB105能夠促進(jìn)煙草和水稻等植物生長、提高煙草對花葉病毒的抗性,還可以用于防治根結(jié)線蟲病,但是其促生和生防機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過與水稻互作的枯草芽孢桿菌OKB105表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析,結(jié)合其突變體文庫篩選,確定芽孢桿菌促生相關(guān)基因,再對這些基因進(jìn)行定點突變和功能回復(fù),結(jié)合構(gòu)建突變體、高效液相色譜、Real-time PCR、Elisa等技術(shù)確定該促生物質(zhì)和其促生機(jī)理。此外,本研究還評估了芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzoe pv.orzae)的抑菌效果,鑒定出具有抑菌活性的揮發(fā)性物質(zhì),并研究其抑菌機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:1.枯草芽孢桿菌OKB105能夠明顯促進(jìn)水稻株高的生長,促生效果為25.2%。為了揭示其促生機(jī)制,我們對與水稻互作2 h的枯草芽孢桿菌OKB105的表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明,與水稻互作后共有176個基因的表達(dá)水平發(fā)生差異變化,占枯草芽孢桿菌OKB105轉(zhuǎn)錄組的3.8%。針對其功能已知的122個差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能分析,主要涉及新陳代謝、轉(zhuǎn)運、運動性、趨化性等方面,其中4組基因受水稻影響最大,分別是:與碳水化合物、氨基酸代謝及轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因;與轉(zhuǎn)錄調(diào)控子相關(guān)的基因;與產(chǎn)孢、運動性、趨化性相關(guān)的基因以及與糖醛酸磷壁酸生物合成相關(guān)基因。這些結(jié)果表明在芽孢桿菌與植物互作的過程中:(1)芽抱桿菌能夠利用植物分泌的物質(zhì)作為碳源和氮源;(2)芽孢桿菌能夠感受周圍環(huán)境的變化作出反應(yīng),提高自身的競爭力;(3)植物能夠通過向芽孢桿菌提供能量來間接的影響其產(chǎn)孢及細(xì)胞壁成分等。我們通過表達(dá)譜芯片技術(shù)分析了與水稻互作后的OKB105差異表達(dá)基因,為進(jìn)一步揭示植物與芽孢桿菌的互作機(jī)制打下基礎(chǔ)。2.我們同時對枯草芽孢桿菌OKB105促生活性物質(zhì)的基本特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)這種促生物質(zhì)熱穩(wěn)定,且分子量3 kDa。隨后對構(gòu)建的OKB105突變體文庫中的700個突變體進(jìn)行篩選,篩選出4個同時對煙草和水稻促生缺陷的突變體。隨后通過反向PCR等技術(shù)對4個突變體中轉(zhuǎn)座子的插入位點進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)4個被突變基因分別為:yecA基因編碼假定的氨基酸/多胺透性酶;yusV基因編碼Fe(Ⅲ)-嗜鐵素轉(zhuǎn)運蛋白,與Fe(Ⅲ)攝取相關(guān);sigH基因編碼RNA聚合酶sigma H因子;comX基因編碼信息素前體,與感受態(tài)形成相關(guān)。結(jié)合表達(dá)譜數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)譜數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的speA基因和本章篩選出的yecA基因都與多胺相關(guān)。speA基因編碼精氨酸脫羧酶,參與多胺的生物合成,yecA則與多胺轉(zhuǎn)運有關(guān)。因此,我們推測枯草芽孢桿菌OKB105對植物的促生活性與多胺有關(guān)。3.為了證實這一猜測,我們構(gòu)建了yecA和speB的定點突變體,編碼假定的氨基酸/多胺透性酶的yecA基因和編碼胍丁胺酶的speB基因分別參與枯草芽孢桿菌OKB105的多胺分泌和生物合成過程,這兩個基因的破壞都會導(dǎo)致OKB105促生能力的缺陷,而speB的功能回復(fù)體則會恢復(fù)其對植物的促生效果。隨后結(jié)合衍生及HPLC技術(shù)對OKB105及其突變體的發(fā)酵上清液進(jìn)行分析,確定亞精胺是OKB105促進(jìn)植物生長的關(guān)鍵物質(zhì)。同時用不同濃度人工合成的亞精胺浸種處理煙草,發(fā)現(xiàn)5-100μM的亞精胺確實能夠促進(jìn)煙草根的生長。通過Real-time PCR檢測煙草體內(nèi)促生相關(guān)基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)OKB105、speB功能回復(fù)體和5μM亞精胺處理過的煙草的擴(kuò)張蛋白基因Nt-EKPA1和Nt-EXPA2上調(diào)表達(dá),乙烯合成相關(guān)基因ACO1下調(diào)表達(dá),而ELISA結(jié)果同樣證明OKB105、speB功能回復(fù)體和亞精胺處理能夠明顯降低煙草葉片的乙烯含量。這些結(jié)果表明OKB105分泌的亞精胺在一定程度上通過誘導(dǎo)擴(kuò)張蛋白相關(guān)基因的表達(dá)和抑制乙烯的合成來促進(jìn)植物的生長。我們首次證實了芽孢桿菌通過分泌亞精胺促進(jìn)植物生長,揭示了芽抱桿菌促生的一種新機(jī)制。4.本論文還對芽抱桿菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性進(jìn)行了評估。首先對50株芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑細(xì)菌活性進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌OKB105和蠟樣芽孢桿菌D13產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠明顯抑制水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的菌落生長和細(xì)胞活性。通過掃描電鏡和透射電鏡技術(shù)對Xoo的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)對照Xoo細(xì)胞壁光滑,細(xì)胞呈桿狀,而揮發(fā)性物質(zhì)處理后的Xoo細(xì)胞壁凹陷,細(xì)胞變得畸形、膨脹或是皺縮,不呈桿狀,且細(xì)胞質(zhì)濃縮。此外,D13揮發(fā)性物質(zhì)處理能夠降低Zoo的致病力和抑制致病相關(guān)基因的表達(dá)。隨后,我們通過氣質(zhì)聯(lián)用對OKB105和D13產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析,鑒定出OKB105產(chǎn)生的7個揮發(fā)性物質(zhì)和D13產(chǎn)生的12個揮發(fā)性物質(zhì)。其中,癸醇和3,5,5-三甲基己醇能夠抑制Xoo的生長,并且3,5,5-三甲基己醇對水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、番茄細(xì)菌性斑點病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)和番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum pv.tomato)也有同樣的抑制效果,說明其對病原細(xì)菌具有廣譜毒性。
[Abstract]:The results showed that Bacillus subtilis OKB105 can promote the growth of plants such as nitrogen , phosphorus and other plant hormones , such as growth hormone , secretory growth hormone , schizoid , gibberellin and so on . The results show that Bacillus subtilis OKB105 can promote the growth of plants such as tobacco and rice , and to produce 2 , 3 - butanediol , 3 - hydroxy - 2 - butanone and other volatile substances . In order to confirm this speculation , we have found that the genes encoding arginine decarboxylase , yecA gene encoding putative amino acid / polyamine and the speB gene encoding guanidinase are involved in the growth of plants . The same inhibitory effect was also found in the bacterial blight of tomato ( Pseudomonas syringae pv . vulgaris DC3000 ) and Ralstonia solanacoccup pv . wilt , which indicated that it had broad - spectrum toxicity to pathogenic bacteria .

【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S182

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本文編號：1705290