本文關(guān)鍵詞： DNA甲基化 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶 二斑葉螨 個體發(fā)育 色型 基因表達(dá)　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：基因組的信息包括遺傳信息與表觀遺傳信息兩大方面。其中,遺傳信息能夠?yàn)樯璧牡鞍踪|(zhì)提供一個藍(lán)圖,而表觀遺傳信息則能夠指導(dǎo)這些遺傳信息以何種形式,何地以及何時(shí)被生物體所利用。而作為其中最為重要并廣泛存在于各生物中的就是基因的DNA甲基化作用。在真核生物中,DNA甲基化作用普遍發(fā)生在胞嘧啶的第五個碳上,因此又稱為胞嘧啶甲基化作用。該過程的皮生是由一類稱為甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)的高度保守的酶所介導(dǎo)的。已有的大量研究證明,由甲基化轉(zhuǎn)移酶所介導(dǎo)的DNA甲基化作用在真核生物正常的細(xì)胞分化、生長發(fā)育、表型變化以及其他重要的代謝過程中起到舉足輕重的作用。因此,通過對生物中催化甲基化產(chǎn)生的甲基化作用機(jī)制系統(tǒng)進(jìn)行詳細(xì)了解,可以進(jìn)一步明確DNA甲基化對發(fā)育及代謝調(diào)控的作用。二斑葉螨(Tetranychus urticae Koch)是一種世界性的農(nóng)業(yè)害螨,能夠危害多達(dá)1,100多種植物。如今,它以其發(fā)育歷期短、易于飼養(yǎng)等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)逐漸被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的遺傳學(xué)研究。雖然二斑葉螨的發(fā)育歷期較短,但是卻具有較為復(fù)雜的發(fā)育可塑性。此外,二斑葉螨中具有單、雙倍體決定性別的機(jī)制,受精卵發(fā)育成為雌性個體,而未受精卵的則發(fā)育成為雄性個體。發(fā)育成熟后的雌螨個體存在著典型的性二型現(xiàn)象。更有意思地是,在自然界中,二斑葉螨通常會以兩種色型存在:一種是體色為黃綠色的綠色型;另一種則體色為洋紅色的紅色型,又稱為朱砂葉螨[T.cinnabarinus(Boisduval)]。越來越多的證據(jù)支持這兩種色型擁有相似的遺傳背景,即可能是一個種有兩個表現(xiàn)型的現(xiàn)象。而這種現(xiàn)象的產(chǎn)生很有可能是DNA甲基化作用所造成的。鑒于大量針對DNA甲基化調(diào)控表型變化的研究成果,DNA甲基化的這種調(diào)控作用是否會在二斑葉螨的個體發(fā)育以及兩種色型形成的過程也得到延續(xù),是值得探究的一個問題。為了解決以上的科學(xué)問題,本研究首次利用RACE技術(shù)對二斑葉螨中甲基化轉(zhuǎn)移酶3基因(Tudnmt3)進(jìn)行克隆,并利用生物信息學(xué)手段分析該基因的初級、二級以及三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,Tudnmt3具有從頭甲基化活性所必需的3個保守結(jié)構(gòu)域(PWWP結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域和催化活性結(jié)構(gòu)域)與6個高度保守的模體。并且,二級與三級蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果同樣反映出它與數(shù)據(jù)庫中已知的甲基化轉(zhuǎn)移酶3具有高度的保守性,且擁有與甲基化轉(zhuǎn)移酶3構(gòu)象的激活和穩(wěn)定所必需的氨基酸殘基。綜上所述,一系列的生物信息學(xué)分析反映出Tudnmt3的確是屬于從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶3家族,結(jié)構(gòu)更傾向于甲基化轉(zhuǎn)移酶3a,推斷Tudnmt3在二斑葉螨中是具有活性的,并且可能起到重要的從頭甲基化作用。既然Tudnmt3基因具備著從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶3家族所必需要的活性模體,也就說明它可能在二斑葉螨的個體的生長發(fā)育甚至基本代謝過程中起到重要的調(diào)控作用。因此,本研究中對二斑葉螨中的甲基化轉(zhuǎn)移酶3可能起到的功能作用進(jìn)行了初步的探究。熒光定量PCR的結(jié)果顯示Tudnmt3在二斑葉螨的整個生活史中具普遍表達(dá)。但是,在雌雄不同性別的發(fā)育歷期中表達(dá)模式并不相同。整體原位雜交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為Tudnmt3可能與雌雄成螨的性腺發(fā)育分化有關(guān)提供了有利的證據(jù)。后續(xù)的MSAP(methylation-sensitive amplification polymorphism)技術(shù)所獲得的119個位點(diǎn)進(jìn)行分析,表明了雌雄成螨的甲基化模式的略微不同,這樣的結(jié)果暗示了雌雄成螨中DNA甲基化模式的不同可能是Tudnmt3的不同的甲基化活性所引起的。為了更好地闡述甲基化轉(zhuǎn)移酶3在二斑葉螨雌雄成螨中的功能,本研究對雌雄葉螨中甲基化轉(zhuǎn)移酶3蛋白的表達(dá)量,以及其在體內(nèi)的定位進(jìn)行了一系列的分析。蛋白印記的結(jié)果顯示這個蛋白在兩種性別中均有表達(dá),但在雌成螨中顯著高于雄成螨,這是與先前研究中該基因的轉(zhuǎn)錄水平的趨勢是不一致的,可能暗示了該基因發(fā)生了翻譯后修飾。后續(xù)的免疫熒光檢測結(jié)果進(jìn)一步證明了甲基化轉(zhuǎn)移酶3在雌成螨中的表達(dá)量高于雄成螨,并且發(fā)現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)移酶3是定位于細(xì)胞質(zhì)中,且主要在葉螨的生殖區(qū)域表達(dá),支持了先前的假設(shè):在二斑葉螨中由甲基化轉(zhuǎn)移酶3所介導(dǎo)的從頭甲基化作用可能在性腺發(fā)育或者配子的形成有關(guān),并且作用機(jī)制是不同于維持型甲基化轉(zhuǎn)移酶的。先前的一系列研究證明了在二斑葉螨的個體發(fā)育過程中,從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶所介導(dǎo)的DNA甲基化作用起到了一定的調(diào)控作用�；诂F(xiàn)有的證據(jù)證明甲基化轉(zhuǎn)移酶與社會型昆蟲的級型變化有關(guān),這個基因是否會在二斑葉螨兩種色型的發(fā)育過程也發(fā)揮重要作用,尤其是否與體色分化有關(guān),是值得研究的。本研究主要利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了Tudnmt3在二斑葉螨紅色型(TuR)與綠色型(TuG)不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,Tudnmt3基因在中國二斑葉螨兩種色型的各個發(fā)育時(shí)期均具普遍表達(dá),并且在發(fā)育過程中具有相似的表達(dá)趨勢,隨著齡期的增長,表達(dá)量逐漸下降。其中,卵的發(fā)育時(shí)期是表達(dá)量最高的,統(tǒng)計(jì)分析顯示顯著高于成螨階段(P0.05)。從不同表型對應(yīng)的相同階段的分析,發(fā)現(xiàn)Tudnmt3基因的表達(dá)量是存在差異但只有在成螨階段中的表達(dá)量達(dá)到統(tǒng)計(jì)意義,暗示了Tudnmt3基因所介導(dǎo)的從頭甲基化作用在二斑葉螨兩種色型的發(fā)育形成中可能發(fā)揮著一些作用。雖然從頭甲基化作用可能在二斑葉螨的紅、綠色型的體色形成過程中具有作用,但具體是否能夠調(diào)控某些與色素合成相關(guān)的基因表達(dá)從而引起紅、綠色型體色變化是未知的。因此,為了解決這一重要問題,我們利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)尋找兩種表型之間與色素合成相關(guān)的差異表達(dá)基因,初步揭示可能引起兩種色型變化的基因表達(dá)的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種色型共有的與色素合成相關(guān)的基因有83個,其中11個是具有顯著性差異表達(dá)的(FDR0.05)。其次,利用定量PCR技術(shù)檢測10個基因在兩種色型的體色的不同階段的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在紅色型中維持著高的表達(dá)量。同時(shí),對犬尿氨酸3-羥化酶基因和絲氨酸蛋白酶抑制劑27A基因進(jìn)行亞硫酸氫鹽法測序發(fā)現(xiàn),在紅、綠色型體色的不同階段之間存在著甲基化水平的差異,但統(tǒng)計(jì)分析并不顯著(P0.05)。最后,對紅色型的成螨進(jìn)行去甲基化抑制處理發(fā)現(xiàn),犬尿氨酸3-羥化酶基因和絲氨酸蛋白酶抑制劑27A基因的表達(dá)量均出現(xiàn)了極顯著下調(diào)(P0.001),直接證明了 DNA甲基化對色素基因的表達(dá)具有直接的影響。與期望不符地是,低甲基化水平并未對紅色型的體色以及其他生理指標(biāo)產(chǎn)生影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433.7

【參考文獻(xiàn)】

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