本文關(guān)鍵詞：粘蟲脂動(dòng)激素基因的克隆與成蟲期表達(dá)模式分析

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【摘要】：粘蟲Mythimna separata(Walker)是一種典型的季節(jié)性遠(yuǎn)距離遷飛害蟲,也是嚴(yán)重威脅我國(guó)糧食作物生產(chǎn)安全的重大害蟲,廣泛分布于亞洲和澳洲的多個(gè)國(guó)家和地區(qū),每年在我國(guó)南北往返遷飛危害。近年來,由于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)變化以及粘蟲的環(huán)境適應(yīng)能力增強(qiáng),粘蟲在我國(guó)的發(fā)生危害呈現(xiàn)加重趨勢(shì),尤其是2012和2013年在全國(guó)范圍暴發(fā)成災(zāi)。粘蟲的遠(yuǎn)距離遷飛習(xí)性是其防治較為困難的主要原因,而能源物質(zhì)代謝則構(gòu)成了遷飛動(dòng)力的能量基礎(chǔ)。脂動(dòng)激素(Adipokinetic Hormone,AKH)是一類主要由昆蟲的心側(cè)體腺細(xì)胞合成、儲(chǔ)存并釋放到血淋巴的神經(jīng)肽,在能源物質(zhì)代謝、飛行與生殖、逆境生理及免疫反應(yīng)等方面具有重要的調(diào)控作用。粘蟲的飛行肌具有善于飛行的構(gòu)造,糖類和脂類為粘蟲的飛行能源物質(zhì),但有關(guān)粘蟲能源代謝調(diào)控的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。本文以粘蟲雌蛾為研究對(duì)象,采用RT-PCR和RACE技術(shù)對(duì)粘蟲脂動(dòng)激素基因進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆,并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了相應(yīng)的表達(dá)模式。主要研究結(jié)果如下:1、采用RT-PCR和RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得了2個(gè)粘蟲脂動(dòng)激素基因的cDNA序列全長(zhǎng),分別被命名為MsepAKH1(GenBank登錄號(hào):KP979739.1)與MsepAKH2(GenBank登錄號(hào):KX096711.1)。粘蟲脂動(dòng)激素基因MsepAKH1的cDNA序列全長(zhǎng)為449 bp,其中開放閱讀框?yàn)?07 bp,編碼68個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的蛋白分子量為7.61 kDa,理論等電點(diǎn)為8.46。粘蟲脂動(dòng)激素基因MsepAKH2的cDNA序列全長(zhǎng)為668 bp,包含216 bp的開放閱讀框,編碼71個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的蛋白分子量為7.78 kDa,理論等電點(diǎn)為6.13。蛋白保守區(qū)分析發(fā)現(xiàn),MsepAKH1與MsepAKH2均含有典型的脂動(dòng)激素基因家族蛋白結(jié)構(gòu)域,即在成熟肽的第4位、第8位、第9位分別為苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸殘基。2、采用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)果表明,MsepAKH1和煙草天蛾MsexAKH、棉鈴蟲HarmAKH1、二化螟CsupAKH1、小菜蛾P(guān)xylAKH1具有較高的氨基酸序列一致性,均達(dá)53%以上,與煙草天蛾MsexAKH的序列一致性最高達(dá)56.9%。MsepAKH2和棉鈴蟲HarmAKH2、小菜蛾P(guān)xylAKH2、二化螟CsupAKH2、家蠶BmorAKH2的氨基酸序列一致性較高,均達(dá)45%以上,尤其是與棉鈴蟲HarmAKH2的一致性高達(dá)83.1%。進(jìn)化樹分析結(jié)果與氨基酸序列比對(duì)結(jié)果基本一致,這也在一定程度上反映了親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。3、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了粘蟲雌蛾脂動(dòng)激素基因MsepAKH1和MsepAKH2的時(shí)空表達(dá)模式。結(jié)果表明,MsepAKH1在初羽化雌蛾不同組織間的表達(dá)量差異顯著,以頭部和飛行肌內(nèi)表達(dá)為主,在脂肪體、卵巢與中腸內(nèi)的表達(dá)量顯著降低。對(duì)不同日齡雌蛾頭部和飛行肌內(nèi)的MsepAKH1表達(dá)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在7日齡頭部和3日齡飛行肌內(nèi)的表達(dá)量分別顯著高于其他日齡相同組織的表達(dá)量。初羽化雌蛾MsepAKH2的組織表達(dá)模式與MsepAKH1相同,但對(duì)其不同發(fā)育階段表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),在7日齡頭部的表達(dá)量最高,在5日齡飛行肌內(nèi)的表達(dá)量顯著高于其他日齡相同組織的表達(dá)量。本研究首次克隆得到2個(gè)粘蟲脂動(dòng)激素基因的cDNA全長(zhǎng)序列,并從mRNA水平明確了MsepAKH1和MsepAKH2在粘蟲雌蛾不同組織及發(fā)育階段的表達(dá)量差異顯著。本研究有助于闡明粘蟲飛行能源物質(zhì)調(diào)動(dòng)的分子機(jī)制,不僅豐富了粘蟲的遷飛行為發(fā)生與調(diào)控機(jī)制理論,還可為進(jìn)一步深入研究粘蟲脂動(dòng)激素基因的具體功能奠定基礎(chǔ),以期為建立以昆蟲神經(jīng)肽為靶標(biāo)的粘蟲遺傳防治體系提供參考,從而實(shí)現(xiàn)粘蟲的可持續(xù)控制。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.4

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本文編號(hào)：1264135