本文關(guān)鍵詞：小菜蛾堿性磷酸酯酶受體表達(dá)與分子模擬

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【摘要】：【目的】利用原核表達(dá)小菜蛾(Plutella xyllostella)中腸膜結(jié)合堿性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并經(jīng)Ligand blot驗(yàn)證其具有與Cry1Ac毒素結(jié)合的能力;通過同源建模和分子對(duì)接研究Cry1Ac-mALP的結(jié)合模式,預(yù)測(cè)毒素和受體結(jié)合區(qū)域及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)(熱點(diǎn)殘基),為了解毒素-受體互作機(jī)制及分子改造增強(qiáng)Cry毒素活性的研究打下基礎(chǔ)�！痉椒ā酷槍�(duì)小菜蛾mALP全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物,并以小菜蛾c DNA為模板擴(kuò)增mALP基因,雙酶切后用T4連接酶連接至pET-26b原核表達(dá)載體,將構(gòu)建的pET-26b-mALP載體轉(zhuǎn)化Trans1-T1克隆感受態(tài),挑取克隆并提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證,將驗(yàn)證無(wú)誤的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)表達(dá)后的mALP轉(zhuǎn)至PVDF膜上,通過Western blot和Ligand blot分別驗(yàn)證mALP是否成功表達(dá)以及是否具有與Cry1Ac毒素結(jié)合的能力。對(duì)mALP進(jìn)行同源建模、分子動(dòng)力學(xué)模擬以及模型評(píng)價(jià),獲得的mALP最佳三維結(jié)構(gòu)與Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序進(jìn)行分子對(duì)接試驗(yàn),對(duì)確定的最佳毒素-受體復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合區(qū)域和結(jié)合氨基酸位點(diǎn)分析,并通過計(jì)算機(jī)輔助的丙氨酸突變掃描試驗(yàn)確定毒素和受體參與的關(guān)鍵氨基酸殘基�！窘Y(jié)果】擴(kuò)增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)后挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序均顯示構(gòu)建正確。通過原核表達(dá)和Western blot驗(yàn)證成功表達(dá)了mALP蛋白,并經(jīng)Ligand blot試驗(yàn)證實(shí)了原核表達(dá)的mALP具有和Cry1Ac毒素結(jié)合的能力。利用同源建模成功獲得了mALP的三維結(jié)構(gòu),通過Patch DOCK和Fire Dock分子對(duì)接程序,獲得毒素和受體的對(duì)接復(fù)合物,通過溶劑可及表面積變化計(jì)算和Ligplot分析,確定毒素結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ均參與了受體結(jié)合,并且毒素和受體均以疏水結(jié)合和氫鍵結(jié)合模式參與結(jié)合,最后通過熱點(diǎn)殘基預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Cry1Ac毒素和mALP中分別有3個(gè)氨基酸殘基(376ASN、443SER和486SER)和4個(gè)氨基酸殘基(452ARG、499THR、502TYR和513TYR)是參與互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)�！窘Y(jié)論】經(jīng)原核表達(dá)的小菜蛾mALP同樣具有與Cry1Ac毒素結(jié)合的能力,并利用分子模擬技術(shù)預(yù)測(cè)了小菜蛾mALP三維結(jié)構(gòu)及與Cry1Ac毒素結(jié)合模式。
【作者單位】： 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(31401813、31630061) 江蘇省自然基金-青年基金(BK20140744) 江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地自主研究課題(3201613)
【分類號(hào)】：S433.4
【正文快照】： 【研究意義】蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)可在其生命周期中產(chǎn)生一種專一性極強(qiáng)的晶體毒素(crystal toxin,Cry toxin),導(dǎo)致昆蟲腸道細(xì)胞溶解或引發(fā)細(xì)胞凋亡程序,從而殺死昆蟲[1-3]。Cry1Ac毒素作為應(yīng)用最為廣泛的一類微生物殺蟲蛋白,在防治大量田間害蟲中已取得

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1217143