本文關鍵詞：嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的培養(yǎng)特性和浸磷效果，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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氧化亞鐵硫桿菌的分離及生物學特性研究
作者姓名：馮雷 專業(yè)：生物工程 指導老師：謝鴻觀

摘要
氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans,簡稱 T. f)屬革蘭氏陰性無機化能 自養(yǎng)菌、嗜酸、專性好氧,靠氧化基質(zhì)中的 Fe2 +為 Fe3+和低價態(tài)硫為硫酸根而獲 取能量。它

廣泛存在于土壤海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉積硫內(nèi),尤以金屬硫 化礦和煤礦等酸性礦坑水中最為常見。因此，本論文從 T.f 菌的分離純化出發(fā)， 進行了 T. f 菌的生理生化及其生物活性的研究。 本文從浸礦溶液中分離得到的氧化亞鐵硫桿菌進行研究， 結果表明硫酸亞鐵 相對于硫來說是一種速效能源，單質(zhì)硫是長效能源，并且能提供比亞鐵更高的能 量。 關鍵詞：氧化亞鐵硫桿菌，微生物冶金，生物浸礦，分離純化

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Isolation of Thiobacillus and biological characteristics
Name: Feng Lei Major: Bioengineering Supervisor: Xie Hongguan

Abstract
Ferrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans, called T. f) ,an inorganic chemoautotroph Gram negative bacteria, acidophilus, specific aerobic, relying on substrate oxidation in Fe3+ and Fe2+ for the low state of sulfur to sulfuric acid roots and obtain energy， which is widely found in soil water, fresh water, waste, and deposition of sulfur in sulfur springs, especially in sulfide minerals such as acid mine water and coal the most common . Therefore, this paper from the T.f purification and identification of

bacteria in conducting the physiological strain Af its biological activity. This separation from the leaching solution obtained ferrooxidans study results show that compared with ferrous sulfate sulfur is a kind of quick energy, sulfur is a long-lasting energy, and can provide more energy than the ferrous . Key words: Thiobacillus ferrooxidans , microbioleaehin ,Biological leaching ,isolation

II

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目

錄

摘要..................................... I Abstract................................ II 一、 前 言............................ 1

1.1 生物冶金的概念 ............................................................................................................................ 1 1.2 碲礦的生物冶金 ........................................................................................................................... 2 1.3 氧化亞鐵硫桿菌的作用 ................................................................................................................ 3 1.4 本實驗研究內(nèi)容 ........................................................................................................................... 4

二、實驗部分............................. 5
2.1 實驗材料與設備 ............................................................................................................................ 5 2.1.1 菌種采集 ................................................................................................................................. 5 2.1.2 實驗試劑 ................................................................................................................................. 5 2.1.3 實驗儀器 ................................................................................................................................. 5 2.1.4 培養(yǎng)基..................................................................................................................................... 6 2.2 研究方法 ........................................................................................................................................ 7 2.2.1 菌種富集培養(yǎng) ......................................................................................................................... 7 2.2.2 分離純化 ................................................................................................................................. 7 2.2.3 單層平板的制作 ..................................................................................................................... 8 2.2.4 雙層平板的制作 ..................................................................................................................... 9 2.2.5 革蘭氏染色 ............................................................................................................................. 9 2.2.6 pH 測定 ................................................................................................................................ 9 2.2.7 細菌計數(shù)方法 ......................................................................................................................... 9 2.4 生物特性研究 .............................................................................................................................. 11 2.4.1 生長曲線 ............................................................................................................................... 11 2.4.2 氧化亞鐵硫桿菌菌株對能源的利用情況 ........................................................................... 11 2.4.3 最適生長溫度的測定 ........................................................................................................... 11 2.4.4 最適初始 pH 值的測定 ........................................................................................................ 11

結果與討論.............................. 12 結論.................................... 15 致謝.................................... 16 參考文獻................................ 17
III

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一、

前 言

礦物質(zhì)是在工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的物質(zhì)，是經(jīng)濟建設的重要物質(zhì)基礎。我國 含有的礦產(chǎn)資源種類豐富，礦產(chǎn)已探明儲量豐富。我國是一個地大物博的強大國 家，但由于人口基數(shù)大，導至各種資源人均占有量低于世界平均水平。所以我國 礦產(chǎn)資源相對緊缺，富礦多數(shù)已開發(fā)利用，還有很多貧瘠礦，礦含量相對低于其 它富礦，開采難度大�，F(xiàn)有開采技術的開采方式對環(huán)境的破壞程度大，提取礦物 質(zhì)也不完全正確，很多礦仍不能開采。針對目前的情況，微生物浸礦是一種新的 開采方式，具有溶礦率高，不污染環(huán)境等獨特優(yōu)勢。

1.1 生物冶金的概念 生物冶金的概念
生物冶金是利用礦物為營養(yǎng)基質(zhì)的微生物的作用，將礦物中金屬溶解，進分 離、富集、純化而提取金屬的濕法冶金技術。該技術具有流程短、成本低、環(huán)境 友好和低污染等特點，特別適于處理貧礦、廢礦、表外礦及難采、難選、難冶礦 的堆浸和就地浸出。從文獻記載來看，，中國是世界上最早采用生物冶金技術的國 家，早在公元前六、七世紀，就在采銅、鐵過程中不自覺地利用了自發(fā)生長的某 些自養(yǎng)細菌。而在歐洲，這種技術的應用至少始于公元二世紀，從 1687 年開始， 瑞典中部 Falun 礦山的銅礦至少已經(jīng)浸出了 2 百萬噸銅[1]。 在國外，銅，鈾的生物提取以及含砷金礦的預氧化已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。在銅的生 物提取方面， 目前用生物法提取的銅約占世界總銅產(chǎn)量的 25%， 在美國、 加拿大、 澳大利亞、智利等 20 多個國家實現(xiàn)了生物提銅產(chǎn)業(yè)化。在我國，也有 2 座銅的 生物氧化提取廠投入生產(chǎn)。在含砷金礦的生物預氧化方面，隨著自然金開采的日 益枯竭， 含砷難處理金礦己成為開采對象， 含砷金礦的主要礦物是黃鐵礦、 毒砂， 金以微粒成亞顯微形態(tài)包裹在硫化物中或浸染在黃鐵礦、毒砂的晶格中，細磨和 直接氰化法很難提取。而使用氧化亞鐵硫桿菌等細菌分解外部的包裹層，可使金 裸露出來，有利于化學浸出，從而提高金的回收率[2]。目前國外至少有 10 個生 物氧化提金廠己經(jīng)籌建投產(chǎn)，國內(nèi)也建成了 2 個生物預氧化黃金生產(chǎn)廠。在鈾的 生物提取方面，加拿大利用細菌浸鈾的規(guī)模最大、歷史最久，法國、美國、葡萄 牙等國家也實現(xiàn)了細菌浸鈾的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
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目前世界范圍內(nèi)， 生物冶金成功應用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要是銅、 鈾和金銀等, 使用范圍從堆浸法逐步擴展到了地浸法和原地破碎浸礦法，正在向銅、鈾、錳、 鉛、鎳、鉻、鉆、鐵、砷、鋅、鋁等幾乎所有硫化礦的浸出擴大。產(chǎn)業(yè)化相對領 先的國家有智利、澳大利亞、美國、南非、日本等，中國、歐盟也從近幾年先后 投入大量資金開展生物冶金領域的研究�？v觀全球，生物冶金業(yè)化主要在三個方 面，并形成兩大技術[3]。

1.2 碲礦的生物冶金
碲是一種稀有，但有很大利用價值的非金屬資源。在地殼中的含量很少, 僅 有 2×10-7％， 其應用相當廣泛， 主要是用作鋼鐵有色金屬的添加劑, 其次是石油, 化工生產(chǎn)的催化劑,橡膠的硫化劑、促凝劑, 且在玻璃電子工業(yè)中有獨特用途。 目前，碲已經(jīng)成為世界戰(zhàn)略需求資源，從軍事到民用，碲都發(fā)揮著不可替代的作 用。碲礦物有碲金礦（AuTe2）、輝碲鉍礦(Bi2TeS2)和碲銅礦等，都很稀少。輝 碲鉍礦（tetradymite）是一種鉍和碲的硫化物礦物，它具有的淺灰色帶有金屬光 澤，并且還會褪色變暗。有葉、粒、塊狀等。輝碲鉍礦是一種較難獨立成礦的碲 硫化物。 在我國四川石棉縣大水溝發(fā)現(xiàn)的世界罕見的碲原生礦， 有很大開發(fā)前景。 此礦石含碲一般在 1%到 12%，個別高達 36.6%；含鉍一般在 3%到 20%，個別 達 40%以上 。由于碲礦分布相對分散，是一種低品位、難開采礦，同時統(tǒng)開采 方式易造成資源浪費、環(huán)境污染、能源消耗過大等問題。而生物冶金正是能夠解 決上述困難的新發(fā)展方向
[12] [4]

。本文所用的礦樣為原礦經(jīng)浮選獲得的低品位碲精

礦，是以輝碲鉍礦為主的混合硫化礦，用單因子實驗法進行不同 pH 條件下?lián)u瓶 浸出試驗，探究生物浸出時的一系列適宜條件，以期提高碲礦的生物浸出率。

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圖 1-1 輝碲鉍礦（tetradymite）

1.3 氧化亞鐵硫桿菌的作用 氧化亞鐵硫桿菌的作用
氧化亞鐵硫桿菌是嗜酸性化能自養(yǎng)型細菌, 專性好氧, 最佳生長pH值為 2.0～2.5, 最佳生長溫度28～35℃, 能以氧化Fe2 + 、 元素S及金屬硫化物等來獲得 生命過程中所需能量, 并以O2 作為氧化過程中的最終電子受體。這類細菌很早 就被應用于貴金屬的浸出和回收, 適合于從低品位的礦石中浸出稀有貴金屬。細 菌浸出的方法由于具有成本低、能耗小、無污染等特點而獲得廣泛應用, 據(jù)報道 美國有25%左右的銅是通過這種方法開采的[5]。此外在含硫廢水處理和煤的脫 硫、以及脫去硫化氫和二氧化硫等方面也有重要的應用前景。然而由于氧化亞鐵 硫桿菌的野生菌氧化Fe2 + 、 元素S以及金屬硫化物的速度慢, 生長條件要求苛刻, 以及對某些金屬離子缺乏耐受能力等, 從而限制了其應用范圍。所以人們試圖通 過各種馴化與誘變育種的方法來提高氧化亞鐵硫桿菌的適應范圍和應用價值。 在生物浸礦中，最常用的菌種是氧化亞鐵硫桿菌。由于各地的氧化亞鐵硫桿 菌不一樣，生長狀況不一樣，在各種環(huán)境中的含量也不同。所以在將其運用到工 業(yè)生產(chǎn)中，首先要分離得到純的氧化亞鐵硫桿菌菌株。

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1.4 本實驗研究內(nèi)容 本實驗研究內(nèi)容
通過對氧化亞鐵硫桿菌的一些文獻資料的分析，總結前人已有的成果，從實 驗室的浸礦溶液中分離出氧化亞鐵硫桿菌，前對其的一些基本生物活性進行分 析。調(diào)整培養(yǎng)基的各種理化條件，使其最適合氧化亞鐵硫桿菌的生長，從而將此 生產(chǎn)條件調(diào)節(jié)到此環(huán)境，以使氧化亞鐵硫桿菌最大程度的進行生物浸礦。 本文研究內(nèi)容：(1) 分離到氧化亞鐵硫桿菌菌株。 (2) 分析氧化亞鐵硫桿菌的生物學活性。

技術路線：

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二、實驗部分 實驗部分
2.1 實驗材料與設備
2.1.1 菌種采集 本實驗所用菌液為本實驗室以前浸礦培養(yǎng)液。 2.1.2 實驗試劑 蒸餾水，（NH4）2SO4(分析純)，KCI(分析純)，K2HPO4(分析純)， MgSO47H2O(分析純)，Ca(N03)2(分析純)，F(xiàn)eSO47H2O (分析純)，K 2Cr2O7(化學 純)，AgNO3(化學純)，二苯胺磺酸鈉(分析純)，KSCN(分析純)。 2.1.3 實驗儀器 本章實驗所用到的主要儀器及其型號和生產(chǎn)廠家如表 2 一 1 所示:
表 2 一 1 實驗設備

儀器名稱
電子天平 精密 pH 計 臺式高速離心機 空氣浴振蕩器 數(shù)控恒溫浴鍋 電子分析天平 立式壓力蒸汽滅菌鍋 電熱恒溫培養(yǎng)箱 電熱恒溫鼓風干燥箱

型號
YJ2502

產(chǎn)地
上海精密科學儀器有限公司 上海雷磁儀器廠 德國漢堡 EppendorfCor. 哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠 天津市泰斯特儀器有限公司 上海精密科學儀器有限公司 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠 上海一恒科技有限公司 上海一恒科技有限公司

PHS-3 C
5804R HZQ-C DK-98-1 FA1104N YXQ-S-301 DHP 一 9052 DHG9070A

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圖 2-1 部分儀器

2.1.4 培養(yǎng)基 氧化亞鐵硫桿菌的代表培養(yǎng)基是 9K 培養(yǎng)基和利森(Leathen)培養(yǎng)基，其組成 見圖 2-2。

圖 2-2

利森(Leathen)和 9K 培養(yǎng)基的組成[6]

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9K 富集培養(yǎng)基配置方法: 9K 鹽溶液: （NH4）2SO4,3.00g;KCl,0.10g; K2HPO4,0.50g;MgSO47H2O 0.50g; Ca(N03)2 0.01g;按此配方加蒸餾水配溶液 1000mL。 9K 培養(yǎng)基:為 9K 鹽溶液加入 FeSO47H2O 44.6g/L。 改進的 9K 固體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由 A 液、B 液和 C 液三部分組成: A 液: （NH4）2SO4 1.5g;KCI 0.1g，K2HPO40.5g; MgSO47H2O 0.5g， Ca(N03)2 0.01g，KSCN15.4g，蒸餾水 200mL，121oC 滅菌 30min; B 液: FeSO47H2O 22g 蒸餾水 300mL，pH2.0，用微孔濾膜(Φ0.22um)過濾 滅菌; C 液:瓊脂糖 10g，蒸餾水 500mL，1210C 滅菌 20min。

2.2 研究方法 研究方法
2.2.1 菌種富集培養(yǎng) 菌種富集培養(yǎng) 實驗中選用液體 9K 培養(yǎng)基對菌液進行富集篩選。在 250mL 錐形瓶加入 200mL 滅菌后的 9K 鹽溶液和 4.46g FeSO47H2O， 50%的 H2SO4 調(diào)到 pH2.0 左 用 右，接種處于對數(shù)期生長的菌種 5mL，于 30℃、160r/min 搖床中恒溫震蕩培養(yǎng)。 經(jīng)過三到四次傳代培養(yǎng)，使得嗜酸氧化亞鐵硫桿菌成為絕對優(yōu)勢菌[7]。 培養(yǎng)基由淺綠色逐漸加深，最后變?yōu)樽丶t色，溶液混濁，且有沉淀出現(xiàn)。這 表明液體培養(yǎng)基中 Fe2+被氧化成了 Fe3+，即有細菌生長。對該菌液進行計數(shù)，發(fā) 現(xiàn)菌濃度己達到 107~108 個/ml。 2.2.2 分離純化 目前分離菌種主要采用以瓊脂(或瓊脂糖)作凝固劑的固體培養(yǎng)基進行[8]。本 實驗采用稀釋涂布平板法，步驟如下:取菌液 1mL，用 pH=2.5 的稀硫酸按每次稀 釋 10 倍，依次稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 濃度的稀釋液。吸取稀 釋度為 10-4、10-5、10-6 稀釋樣各 0.2mL，分別接種到三個預先準備好的 9K 瓊脂
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固體培養(yǎng)基，涂布均勻，正置于 30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日把培養(yǎng) 皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)圓形凸起狀小菌落(直徑大約 1mm)， 一般需要兩周[9]。將單獨小菌落挑起，每個小菌落分別接種到裝有 5mL9K 液體 培養(yǎng)基的小錐形瓶(或試管)中，以棉球封口，放在 30℃搖床中進行振蕩培養(yǎng)。這 樣培養(yǎng)出的即為單一菌的純培養(yǎng)[10]。如此反復，直到純化為止。操作均在無菌 工作臺上進行，所有器皿均經(jīng)高壓濕熱滅菌，接種環(huán)用酒精燈灼燒消毒。

圖 2-3 2.2.3 單層平板的制作 培養(yǎng)基分為三部分制作： (1)9K 固體培養(yǎng)基([Fe2+]=9g/L)

分離過程圖

A 液:9K 無鐵液體培養(yǎng)基 42mL，pH3.0 B 液:1.5%瓊脂溶液 40mL C 液:14.78%FeS047H20 溶液 18mL (2)9K 固體培養(yǎng)基([Fe2+]=4.5g/L)
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A 液:9K 無鐵液體培養(yǎng)基 42mL，pH.30 B 液:1.5%瓊脂溶液 40mL C 液:7.39%FeS047H20 溶液 18mL 2.2.4 雙層平板的制作 在無菌平皿中倒入已溶化并冷卻至 60℃的瓊脂作底層，待平板凝固后，用 無菌吸管取 0.1mL 處于對數(shù)期的酵母菌菌液于底層平板并放置 1-2h。再分別將 用于分離 T.f 菌的固體培養(yǎng)基 A、B、C 液 3 者混合，迅速倒入混勻，作上層平 板，凝固后備用[11]。 2.2.5 革蘭氏染色 （1）用接種針挑取單個菌落，涂布于干凈載玻片上的一滴無菌水中，風干 （2）滴加結晶紫染色液染 1-2 min，水洗，吸干； （3）用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋處理 1 min，水洗，吸干； （4）用 95%乙醇脫色，流滴至洗脫液無色，一般 20～30 s； （5）用番紅染液復染 2～3 min，水洗； （6）風干后用顯微鏡油鏡觀察。 2.2.6 pH 測定 1、溶液 pH 值用奧立龍 818 型酸度計測定。 2、使用 pH 試紙進行測定。 2.2.7 細菌計數(shù)方法 在測定細菌濃度時，細菌的計數(shù)方法較多，有顯微鏡直接測定法、平板計數(shù) 法、光電比濁法、生物量測定法及 DNA 含量測定法等[12]�？紤]到直觀、起見， 本實驗在菌種性質(zhì)的研究中， 細菌計數(shù)采用顯微鏡直接計數(shù)法， 這包括計數(shù)板法、 涂片染色法、比例計數(shù)法等，以計數(shù)板法最為常用，但該較費時。該法是根據(jù)測 定對象選用特制的載玻片(即計數(shù)板)， 其上刻有己知面積的大小方格(即計數(shù)格)， 當蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)格間的高度為已知，因此計數(shù)格的容積為一定。
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根據(jù)在顯微鏡下測得的該計數(shù)格中的微生物個數(shù)， 可算出單位體積待測液中所含 微生物數(shù)[13]。 該方法操作和步驟如下： (1)備片:取清潔干燥的計數(shù)板與蓋玻片(必要時，可微微烘干，以除去其上附 著的水分)，蓋上蓋玻片。注意蓋玻片要蓋在計數(shù)室兩側[14]。 (2)鏡檢計數(shù)室:在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需 清洗后才能進行計數(shù)。 (3)加樣:用無菌吸管吸取充分搖勻并打散開的待測菌液，小心滴一小滴于蓋 玻片邊緣，菌液自行滲入并布滿計數(shù)室，注意避免產(chǎn)生氣泡。 (4)顯微計數(shù):加樣后靜置 3~5 分鐘，鏡檢。根據(jù)受檢微生物個體大小選用適 宜的物鏡頭，先用低倍物鏡找好計數(shù)室位置，然后換用高倍物鏡進行計數(shù)。計數(shù) 前如發(fā)現(xiàn)菌液過濃，可做一定倍數(shù)稀釋后再制片鏡檢計數(shù)，一般每個小方格內(nèi)有 5~10 個菌體為宜。 一個計數(shù)室選 5 個中格(可選 4 個角和中央的中格)中的菌體進 行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。計數(shù)時注意轉動細調(diào)節(jié) 器，使液層上下菌數(shù)都可測到。每份菌液樣品至少計數(shù)兩次取其均值[8]。 (5)清洗血球計數(shù)板:使用完畢后，將血球計數(shù)板在水龍頭上用水柱沖洗，切 勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘 留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。 (6)結果計算:一個計數(shù)室就是一個大方格，分為 25 個中方格，而每個中方格 又分成 16 個小方格，所以每個計數(shù)室中的小方格數(shù)都是 16X25=400 個。每一個 大方格邊長為 1mm，則每一個計數(shù)室的面積為 1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與 蓋玻片之間的高度為 0.1mm，所以計數(shù)室的容積為 0.1mm3。在計數(shù)時，通常數(shù) 五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上 25，就得出一個 計數(shù)室中的總菌數(shù)，然后再換算成 1mL 菌液中的總菌數(shù)。 設五個中方格中總菌數(shù)為 A，菌液稀釋倍數(shù)為 B，那么，一個計數(shù)室的總菌 數(shù)（即 0.1mm3 中的總菌數(shù)）為（A/5）*25*B；因此 1mL=1000mm3，故 1mL 菌 液中的總菌數(shù)=（A/5）*25*B*10*1000=50000A*B 個。
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2.4 生物特性研究
2.4.1 生長曲線 將預先培養(yǎng)好的細菌分別接種于亞鐵和元素硫的培養(yǎng)基中(接種終濃度為 10×106個/mL),在25~60℃或30℃及pH 10~50的條件下?lián)u床培養(yǎng),2天后每隔 4~8 h取樣,用血小板計數(shù)法測定細菌的數(shù)量[15]。 2.4.2 氧化亞鐵硫桿菌菌株對能源的利用情況 在 100 mL 基本鹽培養(yǎng)基中分別加入 1 g 除菌的單質(zhì)硫或 431 g FeSO47H2O 和 1 g 單質(zhì)硫的混合物、硫代硫酸鈉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、黃鐵礦和鐵閃 鋅礦,分別配成含硫或亞鐵和硫、硫代硫酸鈉、不同碳源、不同礦樣的特別基質(zhì). 然后,按 2.4.1 方法接種,在 30℃條件下分別培養(yǎng) 5 天后,觀察細菌的生長情況. 2.4.3 最適生長溫度的測定 分別 將相同數(shù)量的氧化亞鐵硫桿菌株接種到多份 9 K 葡萄糖液體培養(yǎng)基中， 置于不同溫度條件下，經(jīng) 170 r/min 振蕩培養(yǎng)，第 72 h 時，在顯微鏡下直接計數(shù)， 確定不同溫度下菌株的生長情況[16]。 2.4.4 最適初始 pH 值的測定 將相同數(shù)量的氧化亞鐵硫桿菌株接種到不同初始 pH 值的 9K 葡萄糖液體培 養(yǎng)基中，經(jīng) 30℃、170 r/min 振蕩培養(yǎng)，第 72 h 時于顯微鏡下直接計數(shù)，確定不 同 pH 條件下細菌的生長情況。

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結果與討論 果與討論
通過本次實驗，綜合各項數(shù)據(jù)，進行分析： 1、菌種來源：本實驗采用實驗室原有的浸礦溶液 對研究者與使用者來說，工業(yè)微生物即浸礦菌種的獲得一般有兩種方法： （1）從微生物保存單位直接購買。這樣可以節(jié)省時間，并減少工作量，但 這樣獲得的菌種常常沒有從自然界采集的野生菌適應性強[12]。 （2）直接從自然界中采集野生菌。這種細菌適應性強，故人們常常從自然 界中采集。 2、細菌形態(tài)結構 革蘭氏染色，觀察細菌形態(tài)。菌體形態(tài)特征：該菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時,培養(yǎng) 基的顏色由最初的淺綠色變?yōu)辄S綠色,約 10 天左右在培養(yǎng)皿上長出小菌落,該菌 落為黃褐色、 圓形,直徑約 0. 5—0. 8mm,中部突起,被水合高鐵包裹,質(zhì)地堅硬,較難 挑起[17]。在顯微鏡下該菌為短桿狀,兩端鈍圓,以單個、雙個或幾個呈短鏈狀存在, 能運動,革蘭氏染色陰性。

圖 2-4 細菌顯微結構

3、9K 固體培養(yǎng)基制作
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固體培養(yǎng)基本可由液體培養(yǎng)基中加入一定比例的瓊脂直接制成， 但因瓊脂在 酸性環(huán)境中易于水解，在本實驗中只有將培養(yǎng)基與瓊脂分開滅菌后混合制平板。 A、B 液 121℃濕熱滅菌 15min，C 經(jīng) 0.22um 微孔濾膜過濾除菌，待 A、B 液冷 卻到 60℃與 C 液混合后倒平板，待平板冷卻凝固后即可進行菌液的涂布。 4、營養(yǎng)類型：化能自養(yǎng)菌 在富集培養(yǎng)的實驗中,隨著菌體的生長, 9K 液體培養(yǎng)基的顏色由淺綠色依次 變?yōu)橥咙S色和紅棕色,這是由于溶液中 Fe2+被氧化成 Fe3+,最終有淡黃色黃鉀鐵礬 沉淀生成;實驗還表明該菌能利用亞鐵和單質(zhì)硫生長,但在蛋白胨培養(yǎng)基中不能生 長,所以該菌屬專性化能自養(yǎng)菌。這些實驗結果表明該菌具有氧化亞鐵硫桿菌的 特性。 5、生長曲線 生物氧化過程中 Fe2+濃度以及細胞數(shù)目隨時間變化如圖，T.f 生長進入穩(wěn)定 期，細菌濃度達到最大值 1.3x107 個/mL。穩(wěn)定期可以持續(xù)到第 7d，然后進入衰 亡期[18]。與對照相比，接種處理的培養(yǎng)液中 Fe2+氧化主要發(fā)生在延滯期間，兩天 后 Fe2+基本耗盡。

圖

2-4

氧化亞鐵菌菌株的生長曲線
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6．能源利用情況 圖 2-5 為氧化亞鐵菌菌株亞鐵培養(yǎng)基和硫培養(yǎng)基中的典型生長曲線.由圖 2 可知,培養(yǎng)早期細菌在亞鐵培養(yǎng)基中的增長速度明顯比在硫培養(yǎng)基中的快,但 100 h 后,在硫培養(yǎng)基中的細菌濃度明顯高于在亞鐵培養(yǎng)基中的細菌濃度,細菌濃度達 到 108 個/mL.細菌在利用元素硫時,需要經(jīng)過一段時間誘導自身表達或合成分泌 性疏水胞外物質(zhì),以利于與元素硫接觸,因而在開始階段細菌的濃度較低.但一旦 接觸好后,硫氧化比亞鐵氧化可提供更多的能量,所以培養(yǎng)后期細菌的濃度較高。

圖 2-5

氧化亞鐵菌菌株在亞鐵和硫培養(yǎng)基中的生長曲線

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結論
本次實驗，通過將氧化亞鐵硫桿菌菌液進行倒平板，采用劃線分離法，得到 氧化亞鐵菌株，再進行生物特性的研究，得出以下結論： （1）從實驗室樣品中分離純化得到細菌菌株，觀察：固體培養(yǎng) 10 天后出現(xiàn) 菌落，均為黃褐色，圓形，直徑 1mm，中部突出，質(zhì)地堅硬�？梢岳脕嗚F和 單質(zhì)硫作為能源。 （2）T.ferrooxidans 菌在亞鐵培養(yǎng)基中遲緩時間短，比生長速率高，倍增時 間短，說明硫酸亞鐵相對于單質(zhì)硫是一種速效能源。 (3)在硫培養(yǎng)基中 T.ferrooxidans 菌出現(xiàn)二次，甚至更多次的對數(shù)生長，最終 細菌濃度遠遠高于亞鐵培養(yǎng)基中的細菌濃度，說明單質(zhì)硫是一種長效能源，能提 供比亞鐵更高的能量。 (4)對最佳生長條件的研究表明,在初始 pH 值為 2～2. 5 ,溫度在 30～35 ℃范 圍內(nèi),初始 Fe2+度為 9 g/ L ,接種量為 10 %時,菌株既能維持良好的生長,又能對 Fe2+的氧化速率保持較高水平。下一步將通過傳統(tǒng)誘變技術和現(xiàn)代基因工程手段 改良該菌株,使其滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

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致謝
經(jīng)過半年的忙碌和工作，本次畢業(yè)設計已經(jīng)接近尾聲，作為一個本科生,在 完成畢業(yè)設計過程中，由于經(jīng)驗的匱乏，難免有許多考慮不周全的地方，如果沒 有導師的督促指導，以及一起工作的同學們的支持，想要完成這個設計是難以想 象的。 在這里首先要感謝我的導師謝鴻觀老師。 謝老師平日里工作繁多，但在我做 畢業(yè)設計的每個階段，從查閱資料，設計草案的確定和修改，中期檢查，后期 數(shù)據(jù)分析等整個過程中都給予了我悉心的指導。除了敬佩謝老師的專業(yè)水平 外，他的治學嚴謹和科學研究的精神也是我永遠學習的榜樣，并將積極影響我 今后的學習和工作。 其次要感謝生物工程辦公室雷濘菲、童晉等老師在實驗室的細心指導和李先 鋒、何超等同學們在做實驗過程中對我的幫助，他們在本次設計中都給了我很大 的幫助。另外，在完成實驗及本論文的撰寫過程中，還得到了很多其他老師和同 學的關心與幫助。感謝生物工程專業(yè)所有老師授予我的專業(yè)知識，才使我有能力 完成畢業(yè)設計。感謝我的室友們在此次畢業(yè)論文的完成中給予我的幫助，才能使 我順利的完成畢業(yè)論文。在此我對幫助、關心、支持我的老師和同學表示最誠摯 的謝意。 最后，特別感謝關愛我的父母，沒有他們一直以來的無私支持和鼓勵，本論 文無法順利完成，是他們一直默默的給予我無限的精神支持與勇氣。 再次表達我對所有幫助我、關心我的人的最誠摯的謝意！

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參考文獻
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