本文關(guān)鍵詞：萊茵衣藻MYB、AP2基因干涉對油脂含量的影響及其啟動子區(qū)甲基化初步分析

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【摘要】：微藻是具有生長繁殖快、培養(yǎng)技術(shù)簡單、含油量高等優(yōu)勢的一種微型生物,開發(fā)微藻對于生物新能源的獲取提供了良好的材料。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種模式生物,其基因組測序已經(jīng)全部完成,因此為萊茵衣藻的基因功能研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本試驗通過對萊茵衣藻基因組基因進行干涉從而篩選出和油脂產(chǎn)量相關(guān)的基因。首先通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序法對萊茵衣藻CC124在正常(TAP)與氮饑餓(TAP-N)條件下培養(yǎng)24h的全基因組進行表達差異分析,結(jié)果顯示,在氮饑餓培養(yǎng)條件下,有4493個基因表達上調(diào),其中CrMYB7、Cr MYB8、CrAP2-3、CrAP2-4四個基因表達上調(diào)顯著。因此,對具有MYB結(jié)構(gòu)域的CrMYB7和CrMYB8及AP2結(jié)構(gòu)域CrAP2-3和CrAP2-4四個基因在油脂代謝途徑中功能進行了研究。PCR獲得CrMYB7、CrMYB8、CrAP2-3、CrAP2-4四個基因的干涉片段,構(gòu)建各基因的干涉表達載體,用玻璃珠轉(zhuǎn)化法將干涉載體轉(zhuǎn)入萊茵衣藻CC425中。采用熒光定量PCR方法對干涉后的萊茵衣藻進行檢測,發(fā)現(xiàn)被干涉的基因表達量顯著降低,確定干涉成功,然后進行中性脂測定。運用尼羅紅快速染色測定法測定培養(yǎng)6天的轉(zhuǎn)化藻株的中性油脂含量,發(fā)現(xiàn)CrMYB7-RNAi、CrAP2-4-RNAi兩轉(zhuǎn)化藻株的中性油脂含量降低20%左右。將這兩株進行1-7天油脂積累,生物量測定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化藻株比野生型藻株生長緩慢,但到對數(shù)期生物量大小基本一致。將轉(zhuǎn)化藻株與野生型藻株進行總脂含量的測定,發(fā)現(xiàn)CrMYB7-RNAi和CrAP2-4-RNAi比野生型藻株總脂含量下降12%-18%。為驗證氮饑餓下CrMYB7和CrAP2-4基因表達量升高是否與基因的甲基化相關(guān),本論文研究了萊茵衣藻CC124野生型藻株啟動子區(qū)域甲基化情況,通過重亞硫酸鹽測序法測定CC124在正常條件及減氮條件下啟動子區(qū)域甲基化位點。結(jié)果表明:在正常培養(yǎng)條件下CrAP2-4啟動子區(qū)域200bp內(nèi)出現(xiàn)一個可能存在的甲基化位點,而在氮饑餓情況下沒能預測出甲基化位點。因此,啟動子的去甲基化可能導致了氮饑餓條件下CrAP2-4基因的表達量升高。
【關(guān)鍵詞】：萊茵衣藻 中性油 氮饑 RNA 甲基 重亞硫酸鹽測序
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-25
• 1.1 微藻產(chǎn)油的研究背景9
• 1.2 微藻是新能源開發(fā)的理想生物材料9-15
• 1.2.1 微藻生物柴油的研究現(xiàn)狀9-10
• 1.2.2 影響微藻生長和油脂積累的因素10-13
• 1.2.3 微藻的總油脂及提取方法13
• 1.2.4 微藻三酰甘油代謝的過程13-15
• 1.3 萊茵衣藻的概述15-17
• 1.3.1 萊茵衣藻的分類地位及其細胞結(jié)構(gòu)15-16
• 1.3.2 萊茵衣藻的生活史16
• 1.3.3 選擇萊茵衣藻作為研究對象的優(yōu)勢16-17
• 1.4 基因組基因突變技術(shù)17-18
• 1.4.1 基因敲除和敲入技術(shù)17
• 1.4.2 反義技術(shù)17
• 1.4.3 RNA干擾技術(shù)17-18
• 1.5 MYB家族轉(zhuǎn)錄因子18-21
• 1.5.1 MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征19
• 1.5.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子的作用19-21
• 1.6 AP2基因家族轉(zhuǎn)錄因子21
• 1.7 表觀遺傳學（Epigenetics）21-23
• 1.7.1 DNA甲基化及其原理22
• 1.7.2 植物DNA甲基化途徑22-23
• 1.7.3 DNA甲基化檢測方法23
• 1.8 本實驗的目的及意義23-25
• 第二章 萊茵衣藻MYB與AP2基因的RNA干涉研究25-51
• 2.1 實驗材料25-28
• 2.1.1 實驗所用藻株及其它菌株25
• 2.1.2 構(gòu)建干涉所用的載體25
• 2.1.3 實驗所需儀器、試劑及試劑盒25-26
• 2.1.5 實驗所需要的培養(yǎng)基26-27
• 2.1.6 實驗所用的引物27-28
• 2.2 實驗方法28-36
• 2.2.1 萊茵衣藻CC425培養(yǎng)條件28
• 2.2.2 萊茵衣藻CC425總RNA的提取28-29
• 2.2.3 萊茵衣藻RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA29
• 2.2.4 萊茵衣藻轉(zhuǎn)錄組測序29
• 2.2.5 干涉片段克隆及測序29-31
• 2.2.6 用于構(gòu)建RNAi干涉載體的反向重復片段的獲得31-32
• 2.2.7 RNAi載體的構(gòu)建32-33
• 2.2.8 干涉藻株的生物量檢測33-35
• 2.2.9 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因藻株mRNA水平35-36
• 2.2.10 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因藻株對與中性油脂合成相關(guān)基因的影響36
• 2.3 實驗結(jié)果36-51
• 2.3.1 萊茵衣藻CC124正常條件與減氮條件下的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果36-37
• 2.3.2 qRT-PCR檢測CrMYB7、CrMYB8、CrAP2-3、CrAP2-4 的基因表達豐度37-39
• 2.3.3 干涉片段的PCR克隆測序及T282中間載體的構(gòu)建39-40
• 2.3.4 RNAi載體酶切驗證40-41
• 2.3.5 RNAi轉(zhuǎn)化萊茵衣藻CC425轉(zhuǎn)化子的篩選41-42
• 2.3.6 萊茵衣藻CC425干涉藻株油脂含量及生物量的檢測42-51
• 第三章 CrAP2-4 與CrMYB7啟動子區(qū)域甲基化水平分析51-57
• 3.1 實驗材料51
• 3.1.1 實驗所需藻種51
• 3.1.2 實驗所需儀器51
• 3.1.3 實驗所需試劑及試劑盒51
• 3.1.4 實驗所需培養(yǎng)51
• 3.1.5 實驗中引物的設(shè)計51
• 3.2 實驗方法51-53
• 3.2.1 藻株的培養(yǎng)51
• 3.2.2 萊茵衣藻CC124的DNA的提取51-52
• 3.2.3 DNA重亞硫酸鹽處理52-53
• 3.2.4 以重亞硫酸鹽處理的DNA模板進行PCR擴增53
• 3.2.5 PCR擴增產(chǎn)物的測序53
• 3.2.6 測序結(jié)果的比對53
• 3.3 實驗結(jié)果與分析53-57
• 3.3.1 重亞硫酸鹽處理結(jié)果比對53-54
• 3.3.2 測序結(jié)果甲基化位點的預測54-57
• 第四章 討論57-61
• 4.1 萊茵衣藻57
• 4.3 MYB、AP2轉(zhuǎn)錄因子57-58
• 4.4 CrMYB7和CrAP2-4 對萊茵衣藻油脂積累的影響58
• 4.5 DNA甲基化58-61
• 第五章 結(jié)論61-63
• 參考文獻63-71
• 致謝71-73
• 個人簡歷73

【參考文獻】

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本文編號：927446