本文關鍵詞：AcMNPV中LEF-10過量表達與聚集對病毒晚期基因表達的影響

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【摘要】：lef-10基因作為苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)的必需基因,其主要參與了病毒DNA的復制和晚期基因表達,屬于晚期表達因子。在之前的研究中發(fā)現(xiàn),LEF-10在大腸桿菌中能夠形成高分子量的復合體并且這種復合體的存在是極其穩(wěn)定的,而我們在Sf9細胞中也同樣觀察到了LEF-10在細胞質(zhì)中形成的聚集體,這種聚集體對病毒的復制以及晚期基因的表達產(chǎn)生的影響,將是本實驗研究的重點。本實驗以p10啟動子控制的mCherry作為報告基因,對宿主細胞中LEF-10的表達和分布情況以及mCherry的表達水平進行分析。實驗發(fā)現(xiàn)當LEF-10均勻分布于細胞核中時,能夠正常發(fā)揮其功能,使得極晚期基因正常表達,一旦LEF-10在細胞質(zhì)中發(fā)生聚集,其不能進入到細胞核中,導致宿主細胞核中的LEF-10減少,不足以支撐某些晚期基因與極晚期基因的轉(zhuǎn)錄活動,從而使得極晚期啟動子p10啟動的mCherry表達量下降。我們根據(jù)這一結(jié)論,建立了LEF-10聚集對基因表達影響的模型。同時,我們發(fā)現(xiàn)LEF-101-65在自身啟動子下表達量要稍低于野生型,它只能恢復全長LEF-10的部分功能。而為了進一步確定LEF-10的過量表達對LEF-10的聚集以及晚期基因表達的影響,我們根據(jù)截短型LEF-101-65的功能與野生型LEF-10相當,但不易在細胞中發(fā)生聚集的特點,分別構(gòu)建了p10啟動子下LEF-10和LEF-101-65過量表達的重組桿狀病毒,在感染Sf9細胞后,對宿主細胞中LEF-10以及LEF-101-65的表達情況進行了分析并檢測了某些晚期基因的表達水平,由于LEF-101-65在自身啟動子下表達量要稍低于野生型,它只能恢復全長LEF-10的部分功能,發(fā)現(xiàn)由p10啟動子啟動的LEF-10的表達量要明顯低于LEF-101-65的表達量,表明LEF-10的過量表達會導致極晚期基因p10的表達量下降。我們認為在LEF-10過量表達時,大量LEF-10在細胞質(zhì)中發(fā)生聚集,病毒晚期基因以及極晚期基因的表達水平降低;而在LEF-101-65過量表達的宿主細胞中,則不會發(fā)生LEF-101-65的大量聚集,使得晚期基因以及極晚期基因的表達不受影響。為了驗證這一觀點,我們選取了五種晚期表達基因pp78/83,vp39,sod,odv-e56,vp-80并檢測了其表達水平,進一步證實了上述觀點。本實驗通過構(gòu)建LEF-10正常表達以及過量表達的重組病毒,驗證了LEF-10在Sf9細胞中的聚集對晚期基因表達的影響,并由此構(gòu)建了LEF-10的聚集與其功能的關系模型,為進一步研究LEF-10的功能奠定了基礎,也為其他能形成復合物的蛋白的研究提供了新途徑。
【關鍵詞】：苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV) LEF-10 蛋白質(zhì)聚集 晚期基因表達 草地貪夜蛾卵巢細胞系(Sf9)
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q786
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文獻綜述11-21
• 1.1 桿狀病毒概述11-15
• 1.1.1 桿狀病毒的起源及分類11-12
• 1.1.2 桿狀病毒的形態(tài)特征及感染周期12-14
• 1.1.3 苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒14-15
• 1.2 桿狀病毒晚期表達因子15-18
• 1.2.1 晚期表達因子15-16
• 1.2.2 其它lef基因介紹16-18
• 1.3 蛋白表達系統(tǒng)18-19
• 1.4 實驗目的、意義及立項依據(jù)19-21
• 第二章 Lef-10聚集的分布及影響21-31
• 2.1 材料與試劑21-22
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒21
• 2.1.2 生化試劑21
• 2.1.3 主要溶液配方21-22
• 2.1.4 主要儀器22
• 2.1.5 引物設計與合成22
• 2.2 實驗方法22-26
• 2.2.1 野生型pTriEx- plef-10_lef10GFP-pp10_mCherry質(zhì)粒構(gòu)建22-24
• 2.2.2 截短型pTriEx- plef-10_lef10165-GFP-pp10_mC herry質(zhì)粒構(gòu)建24-25
• 2.2.3 包裝重組桿狀病毒25
• 2.2.4 極限稀釋法測定病毒滴度25-26
• 2.2.5 重組型桿狀病毒感染Sf9細胞26
• 2.2.6 熒光顯微鏡觀察LEF-10在Sf9細胞中的狀態(tài)26
• 2.2.7 流式細胞實驗26
• 2.3 結(jié)果與分析26-31
• 2.3.1 重組質(zhì)粒pTriEx- plef-10_lef10GFP-pp10_mCherry的克隆26-27
• 2.3.2 截短型pTriEx- plef-10_lef10165-GFP-pp10_mC herry質(zhì)粒的克隆27-28
• 2.3.3 LEF-10聚集導致其功能下調(diào)28-29
• 2.3.4 LEF-10羧基端截短對p10表達的影響29-31
• 第三章 hsp70啟動子啟動LEF-10過量表達31-41
• 3.1 材料與試劑31-32
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒31
• 3.1.2 生化試劑31
• 3.1.3 主要溶液配方31
• 3.1.4 主要儀器31
• 3.1.5 引物設計與合成31-32
• 3.2 實驗方法32-36
• 3.2.1 野生型及截短型LEF-10過量表達質(zhì)粒構(gòu)建32-33
• 3.2.2 熱啟動LEF-10過量表達質(zhì)粒構(gòu)建33-35
• 3.2.3 包裝重組桿狀病毒35
• 3.2.4 熱啟動Hsp70過表達lef-1035-36
• 3.2.5 倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達36
• 3.2.6 流式細胞實驗36
• 3.3 結(jié)果與分析36-41
• 3.3.1 野生型及截短型LEF-10過量表達質(zhì)粒的克隆36-37
• 3.3.2 熱啟動LEF-10過量表達質(zhì)粒的克隆37-38
• 3.3.3 熱啟動LEF-10過量表達熒光結(jié)果38-40
• 3.3.4 lef-10過量表達流式細胞結(jié)果40-41
• 第四章 LEF-10聚集對晚期基因表達水平影響41-46
• 4.1 材料與試劑41-42
• 4.1.1 重組病毒41
• 4.1.2 生化試劑41
• 4.1.3 主要溶液配方41
• 4.1.4 主要儀器41
• 4.1.5 引物設計與合成41-42
• 4.2 實驗方法42-43
• 4.2.1 極限稀釋法測定病毒滴度42
• 4.2.2 重組型桿狀病毒感染Sf9細胞42
• 4.2.3 流式細胞實驗42
• 4.2.4 Sf9細胞RNA提取42-43
• 4.2.5 DNA酶處理及反轉(zhuǎn)錄43
• 4.2.6 半定量PCR檢測病毒晚期基因表達43
• 4.3 結(jié)果與分析43-46
• 4.3.1 LEF-10羧基末端截短影響LEF-10過量表達43-44
• 4.3.2 Sf9細胞RNA提取結(jié)果44-45
• 4.3.3 LEF-10羧基末端截短對晚期基因表達的影響45-46
• 第五章 討論46-49
• 第六章 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-56
• 縮略詞56-57
• 致謝57-58
• 作者簡介58

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本文編號：851196